[發明專利]一種豬流行性腹瀉病毒的培養方法

有效

• 申請號: 201510052418.1
• 申請日: 2015-01-31
• 公開（公告）號: CN104611297B
• 公開（公告）日: 2017-06-30
• 發明（設計）人: 馮曉聲;賈愛卿;王貴平
• 申請（專利權）人: 廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司;四川海林格生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙)44288
• 代理人: 羅偉添

1.一種豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)DMEM培養基的配制：將13.4克DMEM干粉溶于一升的去離子水中，攪拌至完全溶解后，調節pH值至6.8-7.8，并用≤0.22μm的無菌濾膜進行除菌過濾，置于≤4℃的冰箱待用；

(2)在上述配制好的DMEM培養基中加入占DMEM培養基體積1-8％的胎牛血清，并將該DMEM培養基置于培養容器內進行單層細胞的培養；

(3)將形成有單層細胞的培養容器內的DMEM培養基棄去，并用洗液洗滌2-3次；

(4)棄去洗液，向形成有單層細胞的培養容器內加入豬胰蛋白酶、細胞親和劑和步驟(1)中的DMEM培養基，其中豬胰蛋白酶的用量為DMEM培養基體積用量的0.1-0.5％，細胞親和劑用量為DMEM培養基體積用量的0.01-1％；所述的細胞親和劑由原料混合液制成，所述原料混合液由按照質量百分數計的如下組分組成：

所述無機鹽由氯化鈉、氯化鉀和磷酸二氫鈉組成，所述氯化鈉占細胞親和劑總重的0.1-1.2％；所述氯化鉀占細胞親和劑總重的0.1-1％；所述磷酸二氫鈉占細胞親和劑總重的0.16-0.8％；

(5)將步驟(4)中加入豬胰蛋白酶、細胞親和劑和DMEM培養基的單層細胞放置細胞培養箱中靜置培養1分鐘-30分鐘，靜置培養后取出并迅速接種豬流行性腹瀉病毒，混合均勻后放置于細胞培養箱進行培養，收集豬流行性腹瀉病毒液。

2.根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其特征在于，步驟(2)中所述的單層細胞為Vero單層細胞、293單層細胞、ST單層細胞、BHK單層細胞中的任意一種。

3.根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其特征在于，步驟(3)中所述的洗液為無菌去離子水、無菌PBS、無菌無血清DMEM培養液中的任意一種。

4.根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其特征在于，在步驟(4)中所述的細胞親和劑由原料混合液制成，所述原料混合液由按照質量百分數計的如下組分組成：

5.根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其特征在于，所述氯化鈉占細胞親和劑總重的0.2-0.8％；所述氯化鉀占細胞親和劑總重的0.3-0.5％；所述磷酸二氫鈉占細胞親和劑總重的0.25-0.5％。

6.根據權利要求1所述的豬流行性腹瀉病毒的培養方法，其特征在于，所述細胞親和劑的制備方法如下，稱取適量的蘋果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉和去離子水，將蘋果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉溶于去離子水中，過濾即得；

所述蘋果酸、草酸、山梨酸、磷酸、氯化鈉、氯化鉀、磷酸二氫鈉和去離子水，按照如下質量百分比稱取：

蘋果酸0.1-1％，草酸0.12-1.2％，山梨酸0.1-1％，磷酸0.01-0.1％，無機鹽0.36-3％，去離子水余量；其中，無機鹽由氯化鈉、氯化鉀和磷酸二氫鈉組成，所述氯化鈉占細胞親和劑總重的0.1-1.2％；所述氯化鉀占細胞親和劑總重的0.1-1％；所述磷酸二氫鈉占細胞親和劑總重的0.16-0.8％。