[發明專利]一種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養方法

有效

• 申請號: 201510050831.4
• 申請日: 2015-01-31
• 公開（公告）號: CN104560892B
• 公開（公告）日: 2017-01-18
• 發明（設計）人: 馮曉聲;王貴平;賈愛卿;王偉
• 申請（專利權）人: 廣東海大畜牧獸醫研究院有限公司;四川海林格生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市越秀區哲力專利商標事務所(普通合伙)44288
• 代理人: 羅偉添

技術領域

本發明涉及微生物病毒技術領域，具體涉及一種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養方法。

背景技術

鴨黃病毒(鴨坦布蘇病毒)是一種可以導致蛋鴨產蛋機能嚴重下降的病毒，其臨床表現為產蛋率突然下降，產蛋高峰期縮短，嚴重的在短時間內產蛋率可降為零，采食量也會同時下降，個別有死亡現象。病理剖解可見卵巢充血、腫脹、壞死和萎縮等嚴重病變。該病自從2010年首次在國內被發現后，已經造成山東、湖南、廣東等蛋鴨養殖大省蛋鴨大面積減產。目前，許多研究機構在臨床分離到了鴨黃病毒，并在體外進行了細胞感染試驗，試圖通過體外培養來使該病毒增殖以期用于鴨黃病毒疫苗的研制。多篇文獻報道指出，臨床分離到的鴨黃病毒可對多種細胞進行體外感染，如VERO細胞、BHK細胞等，但原代病毒培養過程較為緩慢，病毒滴度不夠高，對于疫苗的研發是一個需要解決的問題。

發明內容

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養方法，本發明所述的培養方法主要通過改變鴨黃病毒與細胞間的微環境，增加病毒與細胞接觸親和度，從而大大提高鴨黃病毒病毒滴度。

為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：

一種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養方法，其包括以下步驟：

A、DMEM培養液的配制：將13.4g DMEM干粉溶于1000ml去離子水中，攪拌至完全溶解后，調節pH值至6.8～7.8，并用≤0.22um的無菌濾膜進行除菌過濾，置于≤4℃的冰箱待用；

B、往上述的DMEM溶液中加入占DMEM培養液體積1％～8％的胎牛血清后，接種細胞進行單層培養；

C、待單層細胞培養好后，棄去培養容器內的DMEM培養液，并用無菌洗液洗2～3次；

D、棄去無菌洗液，然后往培養容器內加入親和劑和步驟A所述的DMEM培養液，其中親和劑的體積用量為DMEM培養液體積用量的0.01％～1％；

E、將培養容器置于細胞培養箱中靜置培養1min～30min后，接種鴨黃病毒，混合均勻后置于細胞培養箱中培養2～5天，收獲病毒液。

具體地，步驟B中所述的細胞為Vero細胞、293細胞、ST細胞、BHK細胞中的一種。

具體地，步驟C中所述的無菌洗液為去離子水、PBS緩沖液、無血清DMEM培養液中的一種。

具體地，步驟D中所述的親和劑由以下按質量百分數計的各組分制備而成：

丙二酸0～1％；磷酸0～1％；

山梨酸0～0.5％；蘋果酸0.01～1％；

無機鹽0～3.5％；去離子水余量。

優選地，步驟D中所述的親和劑由以下按質量百分數計的各組分制備而成：

丙二酸0.03～0.08％；磷酸0.06～0.08％；

山梨酸0.1～0.3％；蘋果酸0.03～0.08％；

無機鹽0.05～3％； 去離子水余量。

優選地，步驟D中所述的親和劑由以下按質量百分數計的各組分制備而成：

丙二酸0.05％；磷酸0.08％；

山梨酸0.3％； 蘋果酸0.05％；

無機鹽0.2％； 去離子水99.32％。

具體地，所述無機鹽為硫酸鈉、磷酸氫二鈉、氯化鉀、氯化鈉中的一種或兩種以上。

具體地，所述的硫酸鈉占親和劑總量的0.15～0.3％；所述的磷酸二氫鈉占親和劑總量的0.1-1.6％；所述的氯化鈉占親和劑總量的0.09-0.9％；所述的氯化鉀占親和劑總量的0.01-1％。

具體地，所述的親和劑是按以下步驟制備而成的：按配方量稱取丙二酸、磷酸、山梨酸、蘋果酸、無機鹽，將上述組分溶于配方量的去離子水中，過濾即得。

相比現有技術，本發明的有益效果在于：

本發明所述的培養方法主要是在培養過程中通過添加親和劑，改變鴨黃病毒與細胞間的微環境，增加病毒與細胞間親和度，使鴨黃病毒更加快速地感染生產用細胞，提高了鴨黃病毒對細胞的感染效率，從而可以在體外培養實驗中更加快速地獲得高病毒滴度的鴨黃病毒，為鴨黃病毒的疫苗研發奠定基礎。

下面結合具體實施方式對本發明作進一步詳細說明。

具體實施方式

一種提高鴨黃病毒病毒滴度的培養方法，其包括以下步驟：

A、DMEM培養液的配制：將DMEM干粉溶于去離子水中，攪拌至完全溶解后，調節pH值至6.8～7.8，并用0.22um的無菌濾膜進行除菌過濾，置于4℃的冰箱待用；