[發(fā)明專利]ALK基因重排檢測探針、試劑盒以及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510049974.3
• 申請日: 2015-01-30
• 公開（公告）號: CN104561356A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 胡文暉;吳詩揚(yáng);廖傳榮;黃萌
• 申請（專利權(quán)）人: 益善生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 曾鳳云;萬志香

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體的是涉及ALK基因重排檢測探針、試劑盒以及方法。

背景技術(shù)

ALK基因編碼的間變性淋巴瘤激酶(anaplasticlymphoma kinase，ALK)首先發(fā)現(xiàn)于間變性大細(xì)胞淋巴瘤中，是靶向治療的重要靶標(biāo)之一。ALK基因位于2號染色體上(位置為2p23)，長度為728kb，全長cDNA含有29個外顯子,全長ALK蛋白含有1620個氨基酸，分子量為177千道爾頓(kDa),254個氨基酸激酶結(jié)構(gòu)域由1123至1376位氨基酸殘基組成，在此之前是一個由氨基酸組成的短跨膜區(qū)。ALK基因重排的斷裂點(diǎn)位于外顯子19和20之間，ALK基因發(fā)生重排后多具有生物學(xué)功能，其表達(dá)產(chǎn)物為嵌合酪氨酸激酶，通過Coiled Coil結(jié)構(gòu)域形成多聚體，引起組成性的ALK激活，ALK信號可通過激活RAS-MEK-ERK,JAK3-STAT3和PI3K-AKT等下游信號通路持續(xù)地促進(jìn)細(xì)胞增殖，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生和轉(zhuǎn)移。

臨床研究表明，針對ALK基因開發(fā)的靶向藥物克唑替尼，對于ALK基因重排陽性的NSCLC患者，表現(xiàn)出顯著的治療活性，并可延長患者的生存期。目前，克唑替尼已獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局(CFDA)的批準(zhǔn)，在中國用于治療間變性淋巴瘤激酶(ALK)陽性的NSCLC患者。因此，與克唑替尼治療配套的ALK基因重排檢測具有明確的臨床意義與檢測必要性。

常用的ALK基因重排檢測方法分為以下三種：熒光原位雜交(FISH)技術(shù)、免疫組織化學(xué)(IHC)和基于PCR的方法(包括qRT-PCR、RACE-PCR或特異性RT-PCR聯(lián)合測序技術(shù))。但上述技術(shù)尚存在一些不足，如熒光原位雜交探針主要使用人工染色體制備，由于在人工染色體中重復(fù)序列在整個基因組中不斷出現(xiàn)，從而導(dǎo)致非特異性的熒光信號，大大降低了FISH檢測的特異性和靈敏度；常規(guī)IHC的陽性標(biāo)準(zhǔn)判定尚未統(tǒng)一；RT-PCR法檢測ALK融合基因雖然快速、簡便易行、能同時明確ALK已知的融合變體的類型，但無法檢測未知的融合型是其最大的不足之處。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一是ALK基因重排檢測試劑盒，該檢測試劑盒可用于高特異性和高準(zhǔn)確性檢測ALK基因重排的情況。

實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下：

ALK基因重排檢測試劑盒，包括有標(biāo)記熒光染料的、針對斷裂點(diǎn)上游的第一組探針和針對斷裂點(diǎn)下游的第二組探針，所述第一組探針為選自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少一條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少一條探針；上述兩組探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光染料顏色不一樣。

在其中一個實(shí)施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少五條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少五條探針。

在其中一個實(shí)施例中，所述第一組探針為選自SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50中的至少八條探針，所述第二組探針為選自SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60中的至少八條探針。

在其中一個實(shí)施例中，所述第一組探針為SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50，所述第二組探針為SEQ ID NO.51—SEQ ID NO.60。

在其中一個實(shí)施例中，所述SEQ ID NO.41—SEQ ID NO.50依次分別由以下引物擴(kuò)增制備得到：SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20。