[發(fā)明專利]一種構(gòu)建細菌的酵母雙雜交cDNA文庫的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510046952.1
• 申請日: 2015-01-29
• 公開（公告）號: CN104651390A
• 公開（公告）日: 2015-05-27
• 發(fā)明（設計）人: 張嘉;朱春節(jié);許玫英;孫國萍;郭俊
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省微生物研究所
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 劉明星

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明屬于生物領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建細菌的酵母雙雜交cDNA文庫的方法。

背景技術(shù)：

酵母雙雜交系統(tǒng)利用了酵母的生長轉(zhuǎn)錄因子GAL4含有的兩個結(jié)構(gòu)域，DNA結(jié)合域(DNA?binding?domain，BD)及轉(zhuǎn)錄激活域(activation?domain，AD)，將已知基因(誘餌基因)和靶基因或含有靶基因的cDNA分別構(gòu)建在含BD及AD質(zhì)粒載體上，當這兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化酵母感受態(tài)細胞，若BD結(jié)合的誘餌蛋白能夠與AD結(jié)合的靶蛋白或文庫中某些cDNA編碼的蛋白相互作用、彼此間結(jié)合時，則會導致位于側(cè)翼的BD與AD在空間上接近，呈現(xiàn)GAL4轉(zhuǎn)錄因子的完全活性，啟動下游的報告基因如Ade、His及Lac等的表達，從而在特定的缺陷培養(yǎng)基上生長。因此，利用酵母雙雜交系統(tǒng)能夠篩選與誘餌蛋白相互作用的蛋白，還可以研究己知蛋白間的相互作用。

其中酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建一般在cDNA兩端加上同源重組序列，然后與靶蛋白載體如pGADT7-Rec共同轉(zhuǎn)化靶蛋白酵母菌株如AH109，在酵母同源重組酶的作用下，cDNA序列整合到載體上，完成cDNA文庫的構(gòu)建。由于絕大多數(shù)真核細胞mRNA?3’端具有Poly(A)尾，所以提取真核生物的總RNA后可通過使用帶有Oligo(dT)的同源重組序列與其配對，僅mRNA可被反轉(zhuǎn)錄，同時反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA已加上同源重組序列。

但是細菌的mRNA絕大部分不帶有Poly(A)尾，并且mRNA僅占總RNA的1-4％，若使用隨機六聚體作為引物，體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板，合成的cDNA中96％來源于rRNA，成分過于復雜?，F(xiàn)有的針對細菌文庫的構(gòu)建一般是通過使用限制性內(nèi)切酶對細菌基因組DNA進行不完全酶切，然后與文庫載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，無法避免內(nèi)切酶對位點的偏向性，大大降低文庫的豐度，因此細菌的cDNA文庫的構(gòu)建及篩選一直被限制。

發(fā)明內(nèi)容：

本發(fā)明的目的是提供一種能高質(zhì)量構(gòu)建細菌的酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建細菌的酵母雙雜交cDNA文庫的方法。

本發(fā)明的酵母雙雜交cDNA文庫的方法，其特征在于，包括以下步驟：

提取細菌總RNA，再去除總RNA中的5s?rRNA、tRNA及小分子RNA，再對mRNA進行富集，使用隨機六聚體作為引物對富集的mRNA進行逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)合成單鏈的cDNA，再通過LD-PCR以單鏈的cDNA為模板擴增獲得雙鏈cDNA，再利用同源重組將全長雙鏈cDNA與文庫載體共同轉(zhuǎn)化靶蛋白酵母菌株，獲得細菌的cDNA文庫。

優(yōu)選，所述的去除總RNA中的5s?rRNA、tRNA及小分子RNA是利用試劑盒MEGAclear^TMKit去除的。

優(yōu)選，所述的對mRNA進行富集是利用試劑盒MICROB?ExpressTM?Bacterial?mRNAEnrichment?Kit(Ambion)對mRNA進行富集。

優(yōu)選，所述的酵母菌株為酵母菌株AH109。

與已有方法相比，本發(fā)明提出了一種以細菌mRNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫的方法。由于是以mRNA為模板，不僅避免了以總RNA反轉(zhuǎn)錄時rRNA產(chǎn)生干擾，也可以避免使用限制性內(nèi)切酶對細菌基因組DNA的位點偏向性，文庫的開放性閱讀框的正確性更高，質(zhì)量非常好。

附圖說明：

圖1是細菌總RNA的電泳檢測圖；

圖2是去除5s?rRNA、tRNA及小分子RNA的RNA樣品的電泳檢測圖；

圖3是富集的mRNA的電泳檢測圖；

圖4是擴增獲得的雙鏈cDNA的電泳檢測圖；

圖5是用BD?CHROMA?SPIN?TE-400濾柱純化回收雙鏈cDNA的電泳檢測圖；

圖6是酵母雙雜交菌株Y2HGOLD的SD/-Leu平板涂布生長圖；

圖7是cDNA文庫質(zhì)量檢測的電泳檢測圖。

具體實施方式：

以下實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不是對本發(fā)明的限制。

實施例1：細菌總RNA的提取