[發(fā)明專利]一種魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510040846.2
• 申請日: 2015-01-27
• 公開（公告）號: CN104611432A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張忠良;何斐;薛泉宏
• 申請（專利權(quán)）人: 西北農(nóng)林科技大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，屬于菌落研究分析領(lǐng)域。

背景技術(shù)

軟腐病是造成魔芋減產(chǎn)、品質(zhì)下降最嚴(yán)重的細(xì)菌性種傳和土傳病害。引起魔芋軟腐病流行的原因復(fù)雜，其中土壤微生物區(qū)系異常是主要原因之一。董坤等分析了土壤微生物數(shù)量與魔芋軟腐病的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)土壤中細(xì)菌、鐮刀菌及卵菌數(shù)量與軟腐病發(fā)病率呈正相關(guān)，放線菌數(shù)量與軟腐病發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)。但不清楚除軟腐病菌外哪些微生物影響了魔芋根系病害發(fā)生，尚無魔芋軟腐病發(fā)病植株根域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)研究報(bào)道。本文擬通過對魔芋軟腐病株與健株根域土壤微生物區(qū)系及土壤養(yǎng)分的系統(tǒng)比較研究，探索魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)特征，進(jìn)而揭示魔芋軟腐病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制，以期為利用微生態(tài)調(diào)控技術(shù)防治魔芋軟腐病提供科學(xué)依據(jù)。

已有研究表明，放射型根瘤菌能抑制植物病原細(xì)菌青枯雷爾氏菌、植物病原真菌西瓜果斑病菌和棉花黃萎病大麗輪枝菌，也能促進(jìn)甜瓜幼苗生長。蘇云金芽孢桿菌是目前世界上應(yīng)用范圍最廣、效果最好的綠色環(huán)保型微生物殺蟲劑，其胞內(nèi)毒蛋白對一代二化螟等多種害蟲有殺滅作用。該菌數(shù)量多，可能通過減少魔芋根區(qū)、根表土壤害蟲數(shù)量及害蟲對魔芋根系的侵害減輕了病原微生物的侵染，降低了軟腐病的發(fā)病率。煙曲霉對煙草青枯病原細(xì)菌茄科雷爾氏菌(Ralstonia?solanacearum)有穩(wěn)定的拮抗作用，其次生代謝產(chǎn)物也具有抗菌和抗腫瘤活性。纖維素鏈霉菌對番茄葉霉病有防治作用[34]。在魔芋健株根區(qū)、根表土壤或根系中，以上4種優(yōu)勢菌大量存在可能與魔芋健康生長密切相關(guān)，為魔芋健康生長時特有的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。

多年來，對魔芋軟腐病的研究及防治重點(diǎn)一直集中在軟腐病原細(xì)菌，對其余有害微生物重視不夠。魔芋軟腐病流行原因復(fù)雜，其中，連作導(dǎo)致田間有害微生物積累、土壤微生物種群結(jié)構(gòu)失衡是引起魔芋軟腐病發(fā)生的一個重要原因。近年來，國內(nèi)外學(xué)者在蘋果、馬鈴薯及黃瓜等作物土傳病害發(fā)生與根際土壤微生物區(qū)系變化方面取得了重要的研究成果，但引起魔芋軟腐病發(fā)生的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變研究很少，有關(guān)魔芋軟腐病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，對魔芋軟腐病發(fā)生的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)改變研究，開辟了有關(guān)魔芋軟腐病發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制研究的先河，具有重大意義。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：一種魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結(jié)構(gòu)分析方法，其創(chuàng)新點(diǎn)在于：具體包括以下步驟：

(1)采集并處理供試樣品：在連作第4年的魔芋種植基地，采集農(nóng)田中與玉米間作的健康及典型軟腐癥狀的魔芋全植株及其根外土壤、根區(qū)土壤、根表土壤及根系，樣品采集及處理參照現(xiàn)有方法進(jìn)行；

(2)準(zhǔn)備培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯蔗糖及高氏1號培養(yǎng)基；

(3)微生物分離計(jì)數(shù)：稀釋平板涂抹法分離計(jì)數(shù)微生物數(shù)量。細(xì)菌、真菌及放線菌分別采用牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯蔗糖及高氏1號瓊脂培養(yǎng)基，均設(shè)3個稀釋度，每個稀釋度重復(fù)3皿，28℃倒置培養(yǎng)，細(xì)菌2d，真菌3d，放線菌8d后計(jì)數(shù)，同時挑取優(yōu)勢菌純化后于斜面培養(yǎng)基保藏；

芽孢細(xì)菌與熒光細(xì)菌數(shù)量：將細(xì)菌培養(yǎng)基上菌落呈蠟樣光澤、皺褶，具有典型芽孢桿菌特征的細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)為芽孢菌；將細(xì)菌培養(yǎng)基上所有呈現(xiàn)熒光的菌落均計(jì)數(shù)為熒光細(xì)菌；

鏈霉菌屬：將高氏1號培養(yǎng)基上具有典型鏈霉菌屬菌落形態(tài)特征的放線菌計(jì)數(shù)為鏈霉菌；

(4)優(yōu)勢菌株鑒定：采用酶解法分別提取細(xì)菌、放線菌總DNA，均采用細(xì)菌通用引物PA、PB進(jìn)行16SrRNA基因擴(kuò)增；

采用CTAB法提取真菌總DNA，rDNA-ITS擴(kuò)增引物為真菌通用引物；將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，采用BLAST方法和CLUSTALX2.0軟件將獲得的序列與NCBI中高相似度序列進(jìn)行同源性比對，Mega5.0軟件中Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹；

(5)土壤pH及養(yǎng)分測定：使用DELTA?320pH計(jì)測定土壤pH；重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定有機(jī)質(zhì)含量；NH4-N含量采用2mol·L^-1KCl浸提，流動分析儀測定；速效P含量采用0.5mol·L^-1NaHCO₃浸提，鉬銻抗比色法測定；速效K含量采用1mol·L^-1NH40Ac浸提，火焰光度法測定。