[發明專利]一種魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結構分析方法

無效

• 申請號: 201510040846.2
• 申請日: 2015-01-27
• 公開（公告）號: CN104611432A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 張忠良;何斐;薛泉宏
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 董芙蓉

1.一種魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結構分析方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

(1)采集并處理供試樣品：在連作第4年的魔芋種植基地，采集農田中與玉米間作的健康及典型軟腐癥狀的魔芋全植株及其根外土壤、根區土壤、根表土壤及根系，樣品采集及處理參照現有方法進行；

(2)準備培養基：牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯蔗糖及高氏1號培養基；

(3)微生物分離計數：稀釋平板涂抹法分離計數微生物數量。細菌、真菌及放線菌分別采用牛肉膏蛋白胨、馬鈴薯蔗糖及高氏1號瓊脂培養基，均設3個稀釋度，每個稀釋度重復3皿，28℃倒置培養，細菌2d，真菌3d，放線菌8d后計數，同時挑取優勢菌純化后于斜面培養基保藏；

芽孢細菌與熒光細菌數量：將細菌培養基上菌落呈蠟樣光澤、皺褶，具有典型芽孢桿菌特征的細菌菌落計數為芽孢菌；將細菌培養基上所有呈現熒光的菌落均計數為熒光細菌；

鏈霉菌屬：將高氏1號培養基上具有典型鏈霉菌屬菌落形態特征的放線菌計數為鏈霉菌；

(4)優勢菌株鑒定：采用酶解法分別提取細菌、放線菌總DNA，均采用細菌通用引物PA、PB進行16SrRNA基因擴增；

采用CTAB法提取真菌總DNA，rDNA-ITS擴增引物為真菌通用引物；將擴增產物進行測序，采用BLAST方法和CLUSTALX2.0軟件將獲得的序列與NCBI中高相似度序列進行同源性比對，Mega5.0軟件中Neighbor-Joining法構建系統進化樹；

(5)土壤pH及養分測定：使用DELTA?320pH計測定土壤pH；重鉻酸鉀氧化-外加熱法測定有機質含量；NH4-N含量采用2mol·L^-1KCl浸提，流動分析儀測定；速效P含量采用0.5mol·L^-1NaHCO₃浸提，鉬銻抗比色法測定；速效K含量采用1mol·L^-1NH40Ac浸提，火焰光度法測定。

(6)數據處理：采用SPSS17.0軟件進行數據分析，Duncan法進行差異顯著性檢驗，病株以D表示，各項指標較健株的增率用ΔH％表示，健株以H表示，按公式一計算。供試樣品中某種優勢細菌數量占該樣品中細菌總數的比例用P％表示，按公式二計算；某種優勢真菌及放線菌所占比例計算與細菌相同；

公式一：ΔH%=D-HH×100;]]>

公式二：

2.根據權利要求1所述的魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結構分析方法，其特征在于：所述步驟(4)中的PA、PB的通用核苷酸序列分別如下：

PA：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；

PB：5’-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’。

3.根據權利要求1所述的魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結構分析方法，其特征在于：所述步驟(4)中真菌通用引物發核苷酸序列如下：

ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；

ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。

4.根據權利要求1所述的魔芋軟腐病株根域土壤微生物群落結構分析方法，其特征在于：所述步驟(5)中土壤pH的測定中水∶土＝5∶1。