[發明專利]一種針對腦腫瘤的DNA靶向納米載藥分子的制備方法

有效

• 申請號: 201510039583.3
• 申請日: 2015-01-26
• 公開（公告）號: CN104645338B
• 公開（公告）日: 2018-05-04
• 發明（設計）人: 何丹農;夏智偉;王萍;嚴一楠;劉婷;金彩虹
• 申請（專利權）人: 上海交通大學;上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司
• 主分類號: A61K47/64
• 分類號: A61K47/64;A61K31/704;A61P35/00
• 代理公司: 上海漢聲知識產權代理有限公司31236
• 代理人: 徐紅銀,郭國中

技術領域

本發明屬生命醫藥領域，涉及一種針對腦腫瘤的DNA靶向納米載藥分子的制備方法。

背景技術

腦惡性膠質瘤由于具有高的滲透率、復發率以及致死率嚴重威脅著人類的健康，傳統的手術治療無法完全切除腫瘤組織，而藥物治療的效率又不足30％。一旦腫瘤發生，人體內的血腦屏障將會被破壞，EPR效應，即增強滲透滯留效應將會使更多納米顆粒通過血腦屏障。但是從外圍腫瘤組織到腫瘤內部組織的過程中，EPR效應將逐漸減弱，內部孔徑也減小到7～100nm。因此，在腦腫瘤的研究中，需要對材料的尺寸和穿透性將提出更高的要求。

納米藥物載體的研究已經趨于成熟，目前主流的藥物載體主要有以下幾大類：合成類大分子物質(中國發明專利：磁性殼聚糖載藥納米粒子及其制備方法，公開號：CN101085359A；中國發明專利：負載藥物的聚氰基丙烯酸酯載藥納米粒的制備方法，公開號：CN101045162A；中國發明專利：一種載藥的共輸送脂質納米遞藥系統，公開號：CN102114000A)、無機材料(中國發明專利：一種載藥緩控釋納米材料的制備方法和應用，公開號：CN101953797A；中國發明專利：一種納米結構磷酸鈣雙載藥體系及其制備方法，公開號：CN102552913B)、有機材料(中國發明專利：基于納米氧化石墨烯的載藥體系，公開號：CN101670108A)、生物大分子(中國發明專利：蛋白載藥納米粒子的合成方法，公開號：CN102949346A)。然而，未見到DNA生物大分子材料配合靶分子作為藥物載體的相關專利。

受益于堿基互補配對原則，DNA材料能夠精確自組裝成具有一定結構和大小的三維構型。同時，預先修飾在DNA鏈上的疊氮基團能夠與多肽分子發生Click反應，為DNA納米載體提供靶向修飾的可能。本發明利用DNA四面體具有良好的生物相容性以及能夠精確自組裝的特性，與針對腦惡性膠質瘤細胞具有靶向性的多肽分子RGERPPR等相結合，構建出一種新型的靶向遞藥系統，具有較高的研究意義和應用價值。

發明內容

針對現有技術中的缺陷，本發明的目的在于提供一種針對腦腫瘤的DNA靶向納米載藥分子的制備方法。本發明目的在于構建一種針對腦腫瘤的新型DNA靶向納米載藥分子。該方法通過選取四條特定的DNA鏈，在一定條件下自組裝成DNA四面體，同時通過疊氮基團與配體多肽分子鍵合。本發明具有很好的生物相容性，且對于腦惡性膠質瘤具有很高的靶向性，在腫瘤研究治療領域具有非常廣闊的應用前景。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：

本發明提供一種針對腦腫瘤的DNA靶向納米載藥分子的制備方法，所述制備方法包括如下：

步驟一、將DNA單鏈加入Tris-MgCl溶液中混合、反應，得DNA四面體溶液(即TDN溶液)；

步驟二、將所述DNA四面體溶液和靶肽溶液加入到PBS溶液、CuSO₄溶液、三(2-羧乙基)膦(TCEP)溶液、叔丁基三氯乙酰亞胺酯(TBTA)溶液的混合溶液中，恒溫發生點擊(click)反應，即得靶向DNA四面體溶液(即靶向TDN溶液)；

步驟三、向所述靶向DNA四面體溶液中加入腫瘤藥物，恒溫震蕩，離心，去上清，所得沉淀即為DNA靶向納米載藥分子。

優選地，步驟一中，所述DNA單鏈為可通過堿基互補配對自組裝成DNA四面體三維構型的DNA單鏈；

所述DNA單鏈的序列如TSP-1(SEQ ID No:1)、TSP-2(SEQ ID No:3)、TSP-3(SEQ ID No:3)、TSP-4(SEQ ID No:4)所示；

所述TSP-3的標記物包括FAM、Cy3等，TSP-4的標記包括N₃。

優選地，步驟一中，所述Tris-MgCl溶液含10mM Tris、50mM MgCl₂、pH為8的水溶液。

優選地，步驟一中，所述反應具體為：在PCR儀中，反應溫度為95℃，10分鐘后快速冷卻至4℃，繼續反應30分鐘。

優選地，步驟二中，所述靶肽的序列包括RGERPPR、GNKRTRG。

優選地，步驟二中，TCEP將所述混合溶液中的Cu²⁺離子還原為Cu¹⁺離子，在TBTA的保護下，Cu¹⁺離子能夠催化預先修飾在DNA單鏈上的N₃基團與靶肽上的炔基基團成環，并通過一定時間的恒溫反應即得靶向DNA四面體溶液(即靶向TDN溶液)。