[發明專利]重組釀酒酵母表達HBsAg的制備工藝及其分離純化工藝、HBsAg和乙肝疫苗

在審

• 申請號: 201510036934.5
• 申請日: 2015-01-23
• 公開（公告）號: CN104628830A
• 公開（公告）日: 2015-05-20
• 發明（設計）人: 梁全;劉海濤;甘建輝;朱征宇;饒洪沖
• 申請（專利權）人: 深圳康泰生物制品股份有限公司
• 主分類號: C07K14/02
• 分類號: C07K14/02;A61K39/29;A61P31/20
• 代理公司: 深圳市盈方知識產權事務所(普通合伙) 44303
• 代理人: 楊賢

技術領域

本發明涉及重組基因的乙肝疫苗制備工藝技術，尤其涉及一種重組釀酒酵母表達乙肝表面抗原(HBsAg)的制備工藝及其分離純化工藝、HBsAg和乙肝疫苗。

背景技術

我國是乙型肝炎高流行區，每年平均報告發病人50多萬例，而接種乙肝疫苗是預防乙型肝炎最有效、最經濟，也是最有保障的方法。我國于1992年將乙型肝炎疫苗納入計劃免疫管理，2009年開始，國家又將乙型肝炎免費接種范圍擴大至對15歲以下青少年兒童，以及醫務人員、大學生和現役軍人等，全國接種乙肝疫苗的需求愈來愈大，覆蓋范圍越來越廣。2010版新版GMP的實施，對藥企的生產及藥品質量提出了更高的要求。如今全國各乙肝疫苗廠家均在積極通過生產技術優化、改進及革新等措施，力求進一步提高生產效率和提升產品質量，以確保接種范圍擴大后的市場需求和質量保證。

現有技術中，在表達HBsAg的重組釀酒酵母細胞破碎和純化的生產過程中，為防止HBsAg被蛋白酶分解，主要采用在破碎前加入苯甲基磺酰氟溶液(苯甲基磺酰氟是一種蛋白酶抑制劑，對眼睛、鼻子及喉嚨有刺激作用)的方法。

然而，發明人在實施本發明的過程中發現，上述加入蛋白酶抑制劑的方案存在以下缺陷：

由于蛋白酶抑制劑半衰期短(約30分鐘)，而在大規模生產中，細胞破碎所需要的時間較長(60～80分鐘)，往往導致破碎過程的后期，蛋白酶抑制劑的作用已經下降或者消失，使破碎釋放出的目標物HBsAg被蛋白酶一定程度的分解，從而提高了后續純化難度，導致純化得到的原液收率及質量均受到影響；另外，由于加入的蛋白酶抑制劑進入緩沖體系，還帶來了二度污染問題。

發明內容

本發明所解決的技術問題是，提供一種重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化工藝，該工藝可在無需在細胞破碎前加入蛋白酶抑制劑的情況下使蛋白酶失去活性，從而避免蛋白酶抑制劑帶來的二度污染，且可明顯提高后續純化得到的原液收率，并大大改善原液的“比活”、“Sub-p24”等質量指標，具有很高的經濟效益及社會效益。

本發明進一步所解決的技術問題是，提供一種重組釀酒酵母表達HBsAg的制備工藝，該工藝可在無需在細胞破碎前加入蛋白酶抑制劑的情況下使蛋白酶失去活性，從而避免蛋白酶抑制劑帶來的二度污染，且可明顯提高后續純化得到的原液收率，并大大改善原液的“比活”、“Sub-p24”等質量指標，具有很高的經濟效益及社會效益。

為了解決上述技術問題，本發明公開了以下方案：

一種重組釀酒酵母表達HBsAg的分離純化工藝，包括有：

細胞破碎步驟，將經過發酵后提取的酵母細胞供入高壓勻漿器內，在15000±1500PSIG壓力下對其進行細胞破碎；

純化步驟，對破碎后的料液進行純化，制備HBsAg原液；

在所述細胞破碎步驟后、純化步驟之前還包括：

料液加熱步驟，對破碎后的料液進行加熱操作，使其溫度上升到50-80℃后，再將其降溫到2～8℃。

優選地，在所述料液加熱步驟中，使其溫度上升到60-80℃。

優選地，在所述料液加熱步驟中，使其溫度上升到60-70℃。

優選地，在所述料液加熱步驟中，使其溫度上升到65±1℃。

優選地，在所述料液加熱步驟中，通過在套設于所述勻漿器外部的夾套中傳遞傳熱介質，對所述勻漿器內經細胞破碎后的料液進行加熱。

優選地，所述夾套中傳熱介質的傳遞方向與勻漿器內料液的流動方向相反。

優選地，在所述細胞破碎步驟之前包括：

冷凍懸液融化步驟，將經過發酵后提取并冷凍保存的酵母細胞懸液從冷凍保存裝置中轉移到溫度穩定在26±1℃的水浴鍋內，至其融化完成；

所述提純步驟包括：

澄清抗原制備步驟，除去在所述勻漿器破碎并加熱后的料液中的酵母菌碎片后，通過加入硅膠380吸附目標抗原，并通過引入硼酸，將抗原由硅膠上解吸附，收集合并洗脫液，制備成澄清抗原；

原液制備步驟，將所述澄清抗原進一步用疏水色譜法純化HBsAg，用硫氰酸鹽處理，用磷酸鹽緩沖液稀釋，除菌過濾后即為原液。

相應地，本發明還公開了一種重組釀酒酵母表達HBsAg的制備工藝，包括發酵步驟和分離純化步驟，所述分離純化步驟采用如上所述的分離純化工藝。

相應地，本發明還公開了一種重組釀酒酵母表達的HBsAg，該乙肝表面抗原采用如上所述的工藝生產制得。