[發(fā)明專利]一種檢測(cè)纖維蛋白原SNP的試劑盒及其方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510036682.6
• 申請(qǐng)日: 2015-01-26
• 公開（公告）號(hào): CN104611431A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李積鳳;王辰;王軍;楊媛華;翟振國(guó);梁燕;張?jiān)葡?/a>
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68
• 代理公司: 四川君士達(dá)律師事務(wù)所 51216
• 代理人: 芶忠義

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)纖維蛋白原SNP的試劑盒，本發(fā)明尤其涉及一種檢測(cè)纖維蛋白原AαThr312Ala(A/G)SNP的試劑盒，本發(fā)明還涉及一種檢測(cè)纖維蛋白原SNP的方法。

背景技術(shù)

慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓(chronic?thromboembolic?pulmonary?hypertension,CTEPH)是指一次或反復(fù)發(fā)生的血栓栓塞導(dǎo)致血栓機(jī)化、肺血管管腔狹窄甚至閉塞，長(zhǎng)期不能緩解，導(dǎo)致肺血管阻力增加，肺動(dòng)脈壓力進(jìn)行性增高，最終導(dǎo)致右心室肥厚和右心衰竭的綜合征。目前報(bào)道，肺血栓栓塞癥(pulmonary?thromboembolism，PTE)后繼發(fā)CTEPH的比率為0.5-8.8％，估測(cè)發(fā)病率至少在4％。我國(guó)PTE的發(fā)病率約為0.23％，即我國(guó)至少有300萬PTE患者，因此我國(guó)約有12萬左右的CTEPH患者。CTEPH病死率極高，有報(bào)道稱，在平均肺動(dòng)脈壓(mean?pulmonary?arterial?pressure,mPAP)>50mmHg的CTEPH患者，其5年生存率不足14％。也有人報(bào)道，若mPAP>50mmHg，則5年生存率約10％，危害超過多種惡性腫瘤。

多數(shù)研究結(jié)果提示PTE患者體內(nèi)的血栓未能及時(shí)溶解而持續(xù)存在，最終導(dǎo)致了CTEPH的發(fā)生。血栓形成的底物及血栓主要成分的來源均為纖維蛋白原，因此纖維蛋白原基因或表達(dá)的異常等均可影響血栓的溶解。我們課題組通過病例對(duì)照研究，發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原AαThr312Ala(A/G)此SNP位點(diǎn)與CTEPH的發(fā)病密切相關(guān)，該研究已于2013年發(fā)表于Plos?One雜志。這為早期發(fā)現(xiàn)CTEPH提供了一個(gè)重要的分子標(biāo)記物。

目前檢測(cè)SNP的技術(shù)有“金標(biāo)準(zhǔn)”——測(cè)序法、大批量的基因芯片法以及傳統(tǒng)的限制性片度長(zhǎng)度多態(tài)性(restriction?fragment?length?polymorphism,RFLP)的方法。測(cè)序法最為準(zhǔn)確，但費(fèi)用過高而不宜廣泛應(yīng)用于患者的常規(guī)臨床檢測(cè)。大批量的基因芯片法因位點(diǎn)的不同而難于一起檢測(cè)，且因CTEPH臨床檢測(cè)的標(biāo)本數(shù)相對(duì)較少而容易造成如下后果：或者浪費(fèi)芯片而造成費(fèi)用過高，或者浪費(fèi)時(shí)間而造成患者等待檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間過長(zhǎng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)纖維蛋白原SNP的試劑盒，解決了現(xiàn)有技術(shù)中存在的費(fèi)用過高或耗時(shí)過長(zhǎng)的問題。

本發(fā)明所采用的第一技術(shù)方案是，一種檢測(cè)纖維蛋白原SNP的試劑盒，包括2.500μl的10×DNA聚合酶緩沖液，2.000μl的dNTP混合物，0.125μl的DNA聚合酶，1.000μl的上游引物，1.000μl的下游引物，1.0ug的基因組模板DNA，1μl的ScaI，2μl的ScaI?buffer，1μl的DNA上樣緩沖液；其中，上游引物為5’cag?agt?gga?agg?cattaa?cag?a?3’；下游引物為5’gggttttgg?ttt?cca?gta?ctt?c?3’。

本發(fā)明所采用的第二技術(shù)方案是，一種檢測(cè)纖維蛋白原SNP的方法，具體按照以下步驟實(shí)施：

步驟1、基因組DNA提取：用購(gòu)自天根生物技術(shù)有限公司的基因組DNA提取試劑盒，從0.75ml人體血細(xì)胞中提取基因組DNA；

步驟2、利用步驟1中提取的基因組DNA為模板進(jìn)行特異性PCR擴(kuò)增；

步驟3、將酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠中電泳，對(duì)基因型進(jìn)行判定。

本發(fā)明的特點(diǎn)還在于，

步驟2中PCR體系為2.500μl的10×DNA聚合酶緩沖液、2.000μl的dNTP混合物、0.125μl的DNA聚合酶、1.000μl的上游引物、1.000的下游引物、1.0ug的基因組模板DNA，補(bǔ)充去離子水至25.000μl。

步驟2中25.000μl?PCR體系的程序設(shè)定如下：94℃5min；94℃40s→52℃40s→72℃40s，25個(gè)循環(huán)；72℃10min。

步驟2中使用的特異性引物為上游引物和下游引物，由Sigma公司合成，序列如下所示：上游引物5’cag?agt?gga?agg?cat?taa?cag?a?3’；下游引物5’ggg?ttt?tgg?ttt?cca?gta?ctt?c?3’。

步驟3在酶切體系中進(jìn)行，所述25.000μl的酶切體系為：20μl的PCR產(chǎn)物、1μl的ScaI、2μl的ScaI?buffer、補(bǔ)去離子水至25.000μl。