[發明專利]一種檢測纖維蛋白原SNP的試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 201510036682.6
• 申請日: 2015-01-26
• 公開（公告）號: CN104611431A
• 公開（公告）日: 2015-05-13
• 發明（設計）人: 李積鳳;王辰;王軍;楊媛華;翟振國;梁燕;張云霞
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 四川君士達律師事務所 51216
• 代理人: 芶忠義

1.一種檢測纖維蛋白原SNP的試劑盒，其特征在于，包括2.500μl的10×DNA聚合酶緩沖液，2.000μl的dNTP混合物，0.125μl的DNA聚合酶，1.000μl的上游引物，1.000μl的下游引物，1.0ug的基因組模板DNA，1μl的ScaI，2μl的ScaI?buffer，1μl的DNA上樣緩沖液；其中，上游引物為5’cag?agt?gga?agg?cat?taa?cag?a?3’；下游引物為5’ggg?ttt?tgg?ttt?cca?gta?ctt?c?3’。

2.一種檢測纖維蛋白原SNP的方法，其特征在于，具體按照以下步驟實施：

步驟1、基因組DNA提取：用購自天根生物技術有限公司的基因組DNA提取試劑盒，從0.75ml人體血細胞中提取基因組DNA；

步驟2、利用步驟1中提取的基因組DNA為模板進行特異性PCR擴增；

步驟3、將酶切產物進行瓊脂糖凝膠中電泳，對基因型進行判定。

3.根據權利要求2所述的檢測纖維蛋白原SNP的試劑盒的方法，其特征在于，所述步驟2中PCR體系為2.500μl的10×DNA聚合酶緩沖液、2.000μl的dNTP混合物、0.125μl的DNA聚合酶、1.000μl的上游引物、1.000μl的下游引物、1.0ug的基因組模板DNA，補充去離子水至25.000μl。

4.根據權利要求3所述的檢測纖維蛋白原SNP的試劑盒的方法，其特征在于，所述步驟2中25.000μl?PCR體系的程序設定如下：94℃5min；94℃40s→52℃40s→72℃40s，25個循環；72℃10min。

5.根據權利要求2所述的檢測纖維蛋白原SNP的試劑盒的方法，其特征在于，所述步驟2中使用的特異性引物為上游引物和下游引物，由Sigma公司合成，序列如下所示：上游引物5’cag?agt?gga?agg?cat?taa?cag?a?3’；下游引物5’ggg?ttt?tgg?ttt?cca?gta?ctt?c?3’。

6.根據權利要求2所述的檢測纖維蛋白原SNP的試劑盒的方法，其特征在于，所述步驟3在酶切體系中進行，所述25.000μl的酶切體系為：20μl的PCR產物、1μl的ScaI、2μl的ScaI?buffer、補去離子水至25.000μl。

7.根據權利要求2所述的檢測纖維蛋白原SNP的試劑盒的方法，其特征在于，所述步驟3中所述的酶切產物的酶切位點如下：5’AGT’ACT3’，3’TCA’TGA5’，序列中間的單引號表示酶切位點；根據上述酶切位點脫氧核糖核苷酸是野生型A還是突變型T對基因型進行判定：

如果酶切產物為176bp、78bp及39bp三種片段，顯示檢測個體基因型為AA基因型，為野生型純合體，電泳結果為三條帶；

如果酶切產物為176bp、117bp、78bp及39bp四種片段，顯示檢測個體基因型為AG基因型，為雜合體，電泳結果為四條帶；

如果酶切產物為176bp及117bp兩種片段，顯示檢測個體基因型為GG基因型，為突變型純合體，電泳結果為兩條帶。