[發明專利]一種中性內切葡聚糖酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201510036517.0
• 申請日: 2015-01-23
• 公開（公告）號: CN104673771B
• 公開（公告）日: 2017-12-19
• 發明（設計）人: 劉森林;區曉陽;邢苗;陳偉釗
• 申請（專利權）人: 深圳大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/70;C12N1/21;C11D3/386;D21D1/02
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 裘暉

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種中性內切葡聚糖酶及其編碼基因與應用。

背景技術

纖維素是植物纖維的主要成分，約占其干重的30～50％，是目前分布最廣的天然碳水化合物，也是地球上最豐富、最廉價的可再生資源。隨著世界人口的激增、全球經濟的飛速發展、糧食的短缺和石油、煤炭和天然氣等不可再生資源正以驚人的速度減少，可再生纖維素資源的開發利用已引起全世界的普遍關注，成為世界各國研究的重大課題。纖維素酶的研究為此開辟了一條廣闊的途徑，特別是近10年來，隨著現代生物技術迅速發展，基因重組技術及其一系列分子生物學技術的應用，使這一領域的研究更為深入，并在應用上將顯示出其潛在的價值。

纖維素酶(cellulase)是降解天然纖維素生成纖維素分子鏈、纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱。所以，纖維素酶不是單一成分的酶，而是一組酶系的總稱。目前根據其催化功能的不同，普遍認為纖維素酶可分為由三類不同水解功能的酶組成：內切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶，β-葡萄糖苷酶。

I、內切型葡萄糖苷酶(endo-1,4-β-D glucanase，EC3.2.1.4，簡稱EBG)，也稱Cx酶、CMC酶、EG。這類酶作用于纖維素分子內部的非結晶區，隨機識別并水解β-1,4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量非還原性術端的小分子纖維素；

II、外切型葡萄糖苷酶(exo-1,4-β-D glucanase，EC3.2.1.91)，也稱C1酶、微品纖維素酶、纖維二糖水解酶(cellobiohydrolase，簡稱CBH)，這類酶從纖維長鏈的非還原性末端水解β-1,4-糖苷鍵，每次切下一個纖維二糖分子；

III、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，EC3.2.1.21，簡稱BG)又稱纖維二糖酶，它能水解纖維二糖以及短鏈的纖維寡糖生成葡萄糖，對纖維二糖和纖維三糖的水解很快，隨著葡萄糖聚合度的增加水解速度下降，這種酶的專一性比較差。

纖維素的降解必須依靠三種組分的協同作用才能完成。外切β-葡聚糖苷酶從纖維索的非還原多聚體末端水解1,4-β-糖苷鍵，將天然纖維素分解為直鏈纖維素，使其轉變成水合非結晶纖維素；內切β-葡聚糖苷酶則水解纖維素的內在糖苷鍵，將直鏈纖維素內部切斷，分解為纖維二糖和纖維寡糖；而β-葡萄糖苷酶則將纖維二糖分解成兩個葡萄糖單位。

內切葡聚糖酶可以分為三種類型：酸性內切葡聚糖酶(最適pH3～5)、中性內切葡聚糖酶(最適pH6～8)和堿性內切葡聚糖酶(最適pH8～10)。酸性纖維素酶主要用于棉及其混紡織物的生物拋光整理上。而中性纖維素酶主要用于牛仔布及其服裝的洗舊石磨處理上。堿性纖維素酶主要家用洗滌劑中，可增強洗滌劑的去污能力，經常使用還可改善織物的表面特性。

酸性內切葡聚糖酶主要由絲狀真菌產生，其產生菌主要包括里氏木霉、康寧木霉、黑曲霉等。酸性內切葡聚糖酶研究再早，但隨著工業應用范圍的不斷擴展和應用研究的不斷深入，酸性葡聚糖酶也顯現出諸多不足。如中堿性條件下酶活性較低或根本沒有活性、穩定性差、pH值食用范圍窄，而且在酸性條件下處理紡織品后會產生褪色現象等，這極大限制了內切葡聚糖酶在堿性洗滌劑、紡織品酶洗整理等工業中的應用。因此，尋找新型、高效、穩定和pH值適應范圍更廣的內切葡聚糖酶意義重大。

由細菌產生的內切葡聚糖酶主要是中性和堿性內切葡聚糖酶，在中性和堿性條件下均具有一定的酶活性及穩定性。與真菌產生的酸性內切葡聚糖酶相比，由細菌產生的中性和堿性內切葡聚糖酶具有其共同而獨特的優越性：(1)pH值適應范圍廣，一般在pH值6-10之間均具有較高的酶活性；(2)穩定性好，可以耐受60℃的高溫；(3)酶成分單一，主要酶活性成分為內切葡聚糖酶，便于工業應用；(4)可用細菌發酵生產，發酵周期短；(5)可以承受很高的pH值，作為洗滌用酶可使衣物經過多次洗滌后手感、外觀等保持鮮艷；(6)可以在中性環境中處理紡織品，不會造成紡織品褪色等。可見，對于條件要求甚高的洗滌和紡織工業用酶，細菌產中性纖維素酶有比傳統酸性纖維素酶更好的優越性。因此，尋找新的具有優良性質的中性纖維素酶對我國造紙工業的可持續發展具有重要意義。

發明內容

為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的首要目的在于提供一種中性內切葡聚糖酶H31基因的核苷酸序列及其氨基酸序列。本發明根據內切葡聚糖酶保守序列設計簡并引物，用PCR的方法成功克隆出中性內切葡聚糖酶基因。

本發明的另一目的在于提供一種含有上述含信號肽編碼序列的H31基因的表達載體。