[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510034630.5
• 申請(qǐng)日: 2015-01-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104745686B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蔣湘;劉二龍;盧麗;呂英姿;樊武疆;姚柏輝;王定國(guó);蘇彩珠;林惠嬌;唐婕;鄭高彬;林學(xué)勤;符其嬌;秦焯敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中華人民共和國(guó)黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司44102
• 代理人: 任重

1.組轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)用引物，其特征在于，所述引物為F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，所述引物的序列分別如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6所示。

2.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)用引物在鑒別轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系與其他作物方面的應(yīng)用。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述其他作物為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大米cry?IA(a/b)、非轉(zhuǎn)基因油菜籽、非轉(zhuǎn)基因小麥或非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿。

4.一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.提取DNA作為反應(yīng)的模板；

S2.采用權(quán)利要求1所述引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB進(jìn)行LAMP檢測(cè)，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷；

其中，S2所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)的反應(yīng)體系為25μL：10×Thermopol?buffer2.5?μL、10μM?的F3和10μM?的B3各0.5μL、40μM?的FIP和40μM?的BIP各1μL、40μM的?LF和40μM的LB各0.5μL、10?mM?的dNTPs4μL、100?mM?的MgSO_4?1μL、8?U/μL?的Bst?DNA?polymerase?1?μL、Template?DNA1μL?和11.5μL?ddH₂O；

S2所述檢測(cè)的反應(yīng)程序?yàn)?3℃恒溫反應(yīng)60min，85℃加熱2min使酶失活，反應(yīng)即結(jié)束；

根據(jù)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行判斷的方法為：

方法一：根據(jù)顏色變化進(jìn)行結(jié)果判斷：向反應(yīng)終體系加入0.2μLSYBR?green?I，1min觀察結(jié)果，陽(yáng)性反應(yīng)呈現(xiàn)黃綠色，而陰性的反應(yīng)保持橙色；

或者，方法二：電泳檢測(cè)判斷：經(jīng)過(guò)1.5%瓊脂糖電泳檢測(cè)，陽(yáng)性反應(yīng)的產(chǎn)物呈梯形條帶，陰性反應(yīng)沒(méi)有梯形擴(kuò)增條帶出現(xiàn)。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法，其特征在于，S2所述環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)反應(yīng)體系中MgSO₄終濃度為2mM。

6.權(quán)利要求4所述轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法的應(yīng)用，其特征在于應(yīng)用于鑒別轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系與其他作物。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述其他作物為轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、轉(zhuǎn)基因玉米品系89034、轉(zhuǎn)基因玉米品系BT11、轉(zhuǎn)基因大米cry?IA(a/b)、非轉(zhuǎn)基因油菜籽、非轉(zhuǎn)基因小麥或非轉(zhuǎn)基因大葉苜蓿。