[發明專利]轉基因苜蓿草J163品系特異性環介導等溫擴增檢測用引物及檢測方法和應用

有效

• 申請號: 201510034630.5
• 申請日: 2015-01-23
• 公開（公告）號: CN104745686B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發明（設計）人: 蔣湘;劉二龍;盧麗;呂英姿;樊武疆;姚柏輝;王定國;蘇彩珠;林惠嬌;唐婕;鄭高彬;林學勤;符其嬌;秦焯敏
• 申請（專利權）人: 中華人民共和國黃埔出入境檢驗檢疫局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 任重

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更具體地，涉及一種轉基因苜蓿草J163品系特異性的環介導等溫擴增(LAMP)檢測引物及檢測方法和應用。

背景技術

轉基因苜蓿草J163品系由孟山都公司開發的耐除草劑的轉基因品系，2005年美國和加拿大批準環境釋放和作為飼料應用，目前還未獲得我國轉基因生物安全證書，尚未批準其進口。

苜蓿草是美國繼玉米、小麥、大豆后第四大農作物，因其蛋白含量約占總干草質量的17％～20％，與其他豆科牧草相比是一種極好的飼料作物。

轉基因苜蓿通過飼料進入動物養殖的食物鏈，致使牛奶、肉等制品成為轉基因食品，可能對于人的健康產生影響。根據《農業轉基因生物安全管理條例》、《農業轉基因生物進口安全評價管理辦法》、《農業轉基因生物進口安全管理辦法》和《農業轉基因生物標識管理辦法》，凡是在中國境內銷售的轉基因生物，必須進行標識。對轉基因產品標識需要檢測方法的支撐。目前對轉基因產品基于核酸基礎上的檢測可以分為4種檢測策略:1)篩查法:對轉基因產品中的啟動子中的啟動子、終止子等通用基因進行篩查；2)基因特異性檢測：對轉基因產品中的外源目的基因進行檢測；3)構建特異性檢測：對外源目的基因與啟動子或終止子的特異連接序列進行檢測；4)品系特異性/轉化事件特異性檢測:對外源片段與宿主基因組DNA特異連接序列進行檢測。

由于啟動子、終止子、目的基因可以有多種組合關系，同一組合轉化同一植物也可產生不同轉化事件，因此篩查法、基因特異性檢測和構建特異性檢測具有局限性，不能完全滿足轉基因產品身份驗證等檢測、監測和安全管理的需求。而品系特異性/轉化事件是指某個外源基因表達框(或片段)插入到宿主基因組某個位置而形成的穩定遺傳轉化。因此轉化事件一旦發生就具有唯一性，針對轉化事件的檢測可以起到身份識別的作用。目前，國內轉基因苜蓿草檢測策略大多采用檢測啟動子、終止子或EPSPS基因等篩查檢測從而確定是否轉基因苜蓿草，但對于不同品系的轉基因苜蓿草不能進行鑒別性檢測，無法滿足轉基因產品身份?驗證等檢測、監測和安全管理的需求。

2000年，Notomi等開發了環介導等溫擴增技術(Loop-mediated?isothermal?amplification,LAMP)，酶在62℃左右進行等溫擴增。該方法具有靈敏度高，特異性好，反應時間短，判定結果方便、不需要昂貴儀器等優勢，廣泛應用于病毒、細菌、寄生蟲的診斷。擴增完成后，加入特殊的染料，可通過肉眼判定結果，可以實現可視化的檢測。但是，針對不同的檢測對象，引物的篩選以及針對性的擴增和檢測條件是獲得高靈敏度、高特異性結果的關鍵，對于同一種檢測對象，采用不同的引物組合，其檢測結果也相差甚遠。目前未見到有轉基因苜蓿草J163該作物品系特異性LAMP可視化檢測方法相關文獻報道。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對現有轉基因苜蓿草采用的篩查檢測技術不能準確地檢測具體的轉基因品系的不足，提供一組轉基因苜蓿草J163品系特異性LAMP檢測用引物，該組引物具有高特異性和靈敏度，基于所述引物及其組合，本發明可成功建立轉基因苜蓿草J163品系特異性LAMP可視化檢測方法。

本發明要解決的另一技術問題是提供轉基因苜蓿草J163品系特異性LAMP可視化檢測方法。

本發明還一要解決的技術問題是提供所述檢測方法的應用。

本發明的上述目的通過以下技術方案予以實現：

本發明通過創造性地分析和大量實驗研究總結，在轉基因苜蓿草J163品系的5’端外源插入片段P-eFMV(啟動子)與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區序列，結合序列信息的分析，設計得到一組共6條特異性的引物。并確定了精確地檢測步驟和條件，建立特異性強、靈敏度高的轉基因苜蓿草J163品系特異性LAMP檢測方法。

具體地，提供一組轉基因苜蓿草J163品系特異性LAMP檢測用引物F3，B3，FIP，BIP，LF和LB，其序列如SEQ?ID?NO.1、SEQ?ID?NO.2、SEQ?ID?NO.3、SEQ?ID?NO.4、SEQ?ID?NO.5、SEQ?ID?NO.6所示：

SEQ?ID?NO.1:F3:5’-CTTCTTTGCCGGGACAAG-3’。

SEQ?ID?NO.2:B3:5’-CATGTGCTGGAACAGTAGTT-3’。

SEQ?ID?NO.3:FIP:5’-AATTAGCTTCCACTCGAGCAGGAACTGAAGTGTTCGGTGG-3’。