[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法和應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510034609.5
• 申請(qǐng)日: 2015-01-23
• 公開（公告）號(hào): CN104745685B
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉二龍;呂英姿;盧麗;蔣湘;樊武疆;姚柏輝;王定國;蘇彩珠;唐婕;林惠嬌;鄭高彬;林學(xué)勤;符其嬌;秦焯敏
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 黃埔出入境檢驗(yàn)檢疫局綜合技術(shù)服務(wù)中心
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司44102
• 代理人: 任重

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(LAMP)檢測(cè)用引物及檢測(cè)方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系由孟山都公司開發(fā)的耐除草劑的轉(zhuǎn)基因品系，2005年美國和加拿大批準(zhǔn)環(huán)境釋放和作為飼料應(yīng)用，目前還未獲得我國轉(zhuǎn)基因生物安全證書，尚未批準(zhǔn)其進(jìn)口。

轉(zhuǎn)基因苜蓿通過飼料進(jìn)入動(dòng)物養(yǎng)殖的食物鏈，致使牛奶、肉等制品成為轉(zhuǎn)基因食品，可能對(duì)于人的健康產(chǎn)生影響。根據(jù)《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全管理?xiàng)l例》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全評(píng)價(jià)管理辦法》、《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物進(jìn)口安全管理辦法》和《農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物標(biāo)識(shí)管理辦法》，凡是在中國境內(nèi)銷售的轉(zhuǎn)基因生物，必須進(jìn)行標(biāo)識(shí)。對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品標(biāo)識(shí)需要檢測(cè)方法的支撐。目前對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品基于核酸基礎(chǔ)上的檢測(cè)可以分為4種檢測(cè)策略:1)篩查法:對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的啟動(dòng)子中的啟動(dòng)子、終止子等通用基因進(jìn)行篩查；2)基因特異性檢測(cè)：對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中的外源目的基因進(jìn)行檢測(cè)；3)構(gòu)建特異性檢測(cè)：對(duì)外源目的基因與啟動(dòng)子或終止子的特異連接序列進(jìn)行檢測(cè)；4)品系特異性/轉(zhuǎn)化事件特異性檢測(cè):對(duì)外源片段與宿主基因組DNA特異連接序列進(jìn)行檢測(cè)。

由于啟動(dòng)子、終止子、目的基因可以有多種組合關(guān)系，同一組合轉(zhuǎn)化同一植物也可產(chǎn)生不同轉(zhuǎn)化事件，特別對(duì)于進(jìn)境監(jiān)管，同一種作物有些轉(zhuǎn)基因品系是允許進(jìn)口，而有些品系可能由于某種原因沒有區(qū)得準(zhǔn)入。因此篩查法、基因特異性檢測(cè)和構(gòu)建特異性檢測(cè)具有局限性，不能完全滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品身份驗(yàn)證等檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和安全管理的需求。而品系特異性/轉(zhuǎn)化事件是指某個(gè)外源基因表達(dá)框(或片段)插入到宿主基因組某個(gè)位置而形成的穩(wěn)定遺傳轉(zhuǎn)化。因此轉(zhuǎn)化事件一旦發(fā)生就具有唯一性，針對(duì)轉(zhuǎn)化事件的檢測(cè)可以起到身份識(shí)別的作用。

2000年，Notomi等開發(fā)了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)，其原理是針對(duì)目的核酸片段的設(shè)計(jì)特異性引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在約62℃進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增。該方法具有靈敏度高，特異性好，反應(yīng)時(shí)間短，判定結(jié)果方便、不需要昂貴儀器等優(yōu)勢(shì)。但是，針對(duì)不同的檢測(cè)對(duì)象，引物的篩選以及針對(duì)性的擴(kuò)增和檢測(cè)條件是獲得高靈敏度、高特異性結(jié)果的關(guān)鍵，對(duì)于同一種檢測(cè)對(duì)象，采用不同的引物組合，其檢測(cè)結(jié)果也相差甚遠(yuǎn)。目前未見到有轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101該作物品系特異性LAMP可視化檢測(cè)方法相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有轉(zhuǎn)基因苜蓿草采用的篩查檢測(cè)技術(shù)不能準(zhǔn)確地檢測(cè)具體的轉(zhuǎn)基因品系的不足，提供一組轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性LAMP檢測(cè)用引物，該組引物具有高特異性和靈敏度，基于所述引物及其組合，本發(fā)明可成功建立轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性LAMP可視化檢測(cè)方法。

本發(fā)明要解決的另一技術(shù)問題是提供轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性LAMP可視化檢測(cè)方法。

本發(fā)明還一要解決的技術(shù)問題是提供所述檢測(cè)方法的應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明通過創(chuàng)造性地分析和大量實(shí)驗(yàn)研究總結(jié)，在轉(zhuǎn)基因苜蓿草J163品系的3‘端外源插入片段E9 3與苜蓿草基因組DNA之間的鄰接區(qū)序列，結(jié)合序列信息的分析，設(shè)計(jì)得到一組共六條特異性的引物。并確定了精確地檢測(cè)步驟和條件，建立特異性強(qiáng)、靈敏度高的轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性LAMP可視化檢測(cè)方法，滿足轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品身份驗(yàn)證等檢測(cè)、監(jiān)測(cè)和安全管理的需求。

具體地，本發(fā)明提供一組轉(zhuǎn)基因苜蓿草J101品系特異性LAMP檢測(cè)用引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB，所述引物的序列分別如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示：

SEQ ID NO.1：F3:5’-TTCCAGAATCCTTGTCAGATTC-3’。

SEQ ID NO.2：B3:5’-GCTGGAATTAGCAAGATAAG-3’。

SEQ ID NO.3：FIP:5’-ATCGATGCGGCCACCACTGACTTGCCAATTGATTGACAAC-3’。

SEQ ID NO.4：BIP:5’-CCCATTTGGACGTGAATGTAGATTAATGCATACGATCCGTCG-3’。

SEQ ID NO.5：LF:5’-GGCTGCAGGTCGATTGAT-3’。