[發(fā)明專(zhuān)利]一種檢測(cè)細(xì)菌氨基糖苷類(lèi)耐藥基因的引物及試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510033921.2
• 申請(qǐng)日: 2015-01-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104561340B
• 公開(kāi)（公告）日: 2017-09-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 任緒義;虞閏六
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 杭州迪安醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 南京蘇高專(zhuān)利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙)32204
• 代理人: 肖明芳

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)細(xì)菌氨基糖苷類(lèi)耐藥基因的引物及試劑盒。

背景技術(shù)

氨基糖苷類(lèi)抗生素是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過(guò)氧橋連接而成的苷類(lèi)抗生素。有來(lái)自鏈霉菌的鏈霉素、小單孢菌的慶大霉素等天然氨基糖苷類(lèi)，還有阿米卡星等半合成氨基糖苷類(lèi)。雖然大多數(shù)抑制微生物蛋白質(zhì)合成的抗生素為抑菌藥，但氨基糖苷類(lèi)抗生素卻可起到殺菌作用，屬靜止期殺菌藥。

氨基糖苷類(lèi)抗生素對(duì)于細(xì)菌的作用主要是抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成，作用點(diǎn)在細(xì)胞30S核糖體亞單位的16SrRNA解碼區(qū)的A部位。研究表明：此類(lèi)藥物可影響細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的全過(guò)程，妨礙初始復(fù)合物的合成，誘導(dǎo)細(xì)菌合成錯(cuò)誤蛋白以及阻抑已合成蛋白的釋放，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

氨基糖苷類(lèi)抗生素在臨床上主要用于敏感需氧革蘭陰性桿菌及陽(yáng)性球菌等致病性細(xì)菌所致的全身感染。由于氨基糖苷類(lèi)抗生素對(duì)銅綠假單胞菌、肺炎桿菌、大腸桿菌等常見(jiàn)革蘭陰性桿菌的PAE較長(zhǎng)，所以，該類(lèi)藥物被廣泛被用于治療需氧革蘭陰性桿菌所致的嚴(yán)重感染，如腦膜炎、呼吸道、泌尿道、皮膚軟組織、胃腸道、燒傷、創(chuàng)傷及骨關(guān)節(jié)感染等。另外，對(duì)于敗血癥、肺炎、腦膜炎等細(xì)菌引起的嚴(yán)重感染，常常使用氨基糖苷類(lèi)及其他類(lèi)別抗生素的聯(lián)合用藥方案，此外，在畜牧業(yè)和中水產(chǎn)業(yè)中，該類(lèi)抗生素不但被廣泛用于防治各種動(dòng)物性疾病，而且常添加到飼料中，用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育。在歐洲，每畝魚(yú)池規(guī)定可以投放50公斤的抗生素，而在我國(guó)動(dòng)物用的劑量根本沒(méi)有明確規(guī)范，通常動(dòng)物剛一出生即使沒(méi)病也要先對(duì)其使用抗生素“預(yù)防”，避免因大規(guī)模發(fā)病而遭受巨大的損失。

近30年來(lái)，由于大量治療用抗生素在臨床的不合理應(yīng)用，臨床疾病相關(guān)細(xì)菌的耐藥性不斷增加，引起正常菌群失調(diào)和大量耐藥菌株出現(xiàn)。耐藥菌能夠承受住抗生素藥物的攻擊，這樣一來(lái)標(biāo)準(zhǔn)的治療就失去了效果，感染持續(xù)存在并可傳染他人。抗生素耐藥性是由使用抗生素藥物，特別是對(duì)抗生素藥物的不當(dāng)使用造成的，當(dāng)細(xì)菌發(fā)生突變或獲得耐藥基因時(shí)，就產(chǎn)生了耐藥性。氨基糖苷類(lèi)藥物在臨床中的廣泛應(yīng)用使得越來(lái)越多的產(chǎn)生了對(duì)該類(lèi)抗生素耐藥的菌株，導(dǎo)致臨床治療失敗。另外，因?yàn)樵谛竽琉B(yǎng)殖業(yè)中廣泛使用氨基糖苷類(lèi)抗生素的情況非常普遍，不僅動(dòng)物、禽類(lèi)及魚(yú)類(lèi)體內(nèi)殘留的抗生素會(huì)轉(zhuǎn)移到人體，它們體內(nèi)產(chǎn)生的耐藥菌和耐藥基因也會(huì)傳播給人類(lèi)。這樣就需要一種能方便快捷的檢測(cè)細(xì)菌耐藥性的方法，從而來(lái)及早發(fā)現(xiàn)耐藥細(xì)菌，進(jìn)而改變用藥方案，指導(dǎo)臨床治療。

耐藥性的檢測(cè)可以分為常規(guī)表型檢測(cè)(即藥敏試驗(yàn))和耐藥基因型檢測(cè)。常規(guī)藥敏試驗(yàn)首先需要通過(guò)培養(yǎng)的方法從臨床標(biāo)本中分離到菌株，而許多生長(zhǎng)較慢和不易培養(yǎng)的細(xì)菌，是無(wú)法通過(guò)常規(guī)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)其耐藥性的。在過(guò)去的2O年，為適應(yīng)臨床需要，以DNA探針和聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為基礎(chǔ)的分子手段檢測(cè)耐藥基因取得了很大進(jìn)展，其中部分方法已被美國(guó)食品和藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)用于臨床工作。從最初的定性PCR和電泳到后期的基因芯片等技術(shù)都可以檢測(cè)細(xì)菌抗生素相關(guān)耐藥基因，但定性PCR及電泳法具有容易污染、操作繁瑣等缺陷，基因芯片技術(shù)可同時(shí)檢測(cè)多個(gè)耐藥基因，但成本也非常高，操作復(fù)雜，所需時(shí)間長(zhǎng)，不適宜臨床大規(guī)模推廣應(yīng)用。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)(Real-time quantitative Polymerase Chain Reaction簡(jiǎn)稱Real Time PCR)是在定性PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的核酸定量技術(shù)，在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)樣品中的DNA(或cDNA)進(jìn)行定量檢測(cè)的方法。該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了對(duì)DNA/RNA模板的定量，而且具有靈敏度和特異性高、能實(shí)現(xiàn)多重反應(yīng)、自動(dòng)化程度高、無(wú)污染、成本低廉等特點(diǎn)。目前已有多種運(yùn)用定量PCR技術(shù)的試劑盒應(yīng)用于臨床疾病相關(guān)的病原體檢測(cè)、基因分型、突變研究等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明需要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種種靈敏、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便的新型檢測(cè)試劑盒，實(shí)現(xiàn)對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌氨基糖苷類(lèi)耐藥基因aac(3)-II、aac(6')-Ib、aph(3')-III、ant(3″)-1a、ant(4')-1a的快速檢測(cè)，以彌補(bǔ)現(xiàn)有檢測(cè)方法的不足。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種檢測(cè)細(xì)菌氨基糖苷類(lèi)耐藥基因的引物，它包括如下引物對(duì)：

(1)擴(kuò)增aac(3)-II耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1～2所示；

(2)擴(kuò)增aac(6')-Ib耐藥基因的引物對(duì)，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3～4所示；