[發(fā)明專利]一種以1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷為骨架的手性順磁探針

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510033470.2
• 申請日: 2015-01-23
• 公開（公告）號: CN104592200A
• 公開（公告）日: 2015-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇循成;楊峰;趙宇
• 申請（專利權(quán)）人: 南開大學(xué)
• 主分類號: C07D401/06
• 分類號: C07D401/06;G01N24/10
• 代理公司: 天津佳盟知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12002
• 代理人: 侯力

技術(shù)領(lǐng)域

?本發(fā)明屬于化學(xué)生物學(xué)研究中的高性能探針，特別是一種以1,4,7,10-四氮雜環(huán)十二烷（cyclen）為骨架的手性順磁探針。

背景技術(shù)

蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)是其生物功能的基礎(chǔ)。順磁效應(yīng)下的核磁共振由于其獨(dú)特的性質(zhì)，近年來在生物大分子（如蛋白質(zhì)、DNA、RNA等）的結(jié)構(gòu)和功能研究中發(fā)揮著越來越強(qiáng)大的作用；順磁效應(yīng)能夠提供其它技術(shù)手段難以獲得的大分子長程結(jié)構(gòu)信息；功能化的順磁標(biāo)簽則是順磁技術(shù)中修飾蛋白質(zhì)最為重要的技術(shù)手段之一。

順磁標(biāo)簽的質(zhì)量對利用順磁核磁研究生物大分子的結(jié)構(gòu)與動態(tài)學(xué)關(guān)系起著決定性的作用。順磁標(biāo)簽一般均是一些具有雙功能團(tuán)的小分子探針，一端用于順磁金屬離子的螯合，另一端則用于與蛋白質(zhì)連接。將順磁標(biāo)簽與生物大分子連接后，利用順磁效應(yīng)可以揭示生物大分子的作用機(jī)制和作用構(gòu)象變化、小分子與大分子作用的高分辨結(jié)構(gòu)（參見：J.?Biomol.?NMR,?2010,?46:?101-112），這將對有效藥物先導(dǎo)分子進(jìn)行篩選與優(yōu)化起到重要的導(dǎo)向作用。

一個好的標(biāo)簽通常需要需要滿足以下條件：1）標(biāo)簽連接的剛性。當(dāng)標(biāo)簽與順磁金屬離子結(jié)合后，若此順磁標(biāo)簽和蛋白質(zhì)的相對位置發(fā)生變化，會使PCS（贋接觸化學(xué)位移）和RDC（殘余偶極耦合）明顯降低；2）光學(xué)純度單一，金屬離子和具有多個潛在手性中心的標(biāo)簽結(jié)合后，會產(chǎn)生對映異構(gòu)體，導(dǎo)致出現(xiàn)多套NMR信號，進(jìn)而使圖譜變得復(fù)雜而難以解析；3）標(biāo)簽與蛋白鏈接的穩(wěn)定性。

Su等（Chembiochem,?2006,?7:?1599–1604.），首先用Ellman’s試劑5,5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）活化蛋白質(zhì)的巰基形成二硫鍵，過量的DTNB通過透析除去；之后加入等量的標(biāo)簽，標(biāo)簽中的巰基即和活化的二硫鍵反應(yīng)生成新的二硫鍵，最終把多肽標(biāo)簽和蛋白質(zhì)連接起來（反應(yīng)過程見圖1）。離去的5-巰基-2-硝基苯甲酸（TNB）呈現(xiàn)明顯黃色，這為反應(yīng)過程的檢測提供了很大的便利。這種標(biāo)記方法產(chǎn)率較高（>70%），因?yàn)長BT多肽標(biāo)簽酸性很強(qiáng)，與蛋白質(zhì)連接之后其pI值會明顯改變，所以可以通過離子交換色譜柱將連接產(chǎn)物和未連接蛋白質(zhì)分離。然而，二硫鍵不穩(wěn)定，這阻礙了此類標(biāo)簽的廣泛應(yīng)用。

Prudencio等（Chem.?Eur.?J.,?2004,?10(3):?3252～3260.）報(bào)道了具有兩個活性巰基的化合物L(fēng)-1（見圖2），其由DTPA雙酸酐和S-(2-氨乙基)甲烷硫代磺酸反應(yīng)得到，合成方法簡單。此標(biāo)簽可以和蛋白質(zhì)上距離8～10?的兩個半胱氨酸殘基同時反應(yīng)，形成兩個二硫鍵，增加了標(biāo)簽的剛性，限制了標(biāo)簽相對于蛋白質(zhì)的運(yùn)動，避免了PCS的平均化，在距離順磁金屬離子4nm處仍有明顯的PCS。但是由于其存在多個手性中心，與蛋白質(zhì)連接以后，滴加順磁金屬離子，會產(chǎn)生至少5個順磁信號峰，致使¹H-¹⁵N?HSQC譜圖非常復(fù)雜。

Li等（Chem.?Commun.?,?2012,?48:?2704–2706.）首次報(bào)道了利用末端烯鍵與蛋白質(zhì)側(cè)鏈巰基的邁克爾加成反應(yīng)將化合物L(fēng)-2（見圖2）定點(diǎn)標(biāo)記到蛋白質(zhì)上，加成產(chǎn)物含有硫醚鍵，它可以在還原性環(huán)境和堿性條件下穩(wěn)定存在。然而化合物L(fēng)-2只有三個配位點(diǎn)，鑭系金屬離子和其配位以后，還能結(jié)合其他配位原子。

Vlasie等（Chem.?Eur.?J.,?2007,?13(6):?1715～1723.）報(bào)道了化合物L(fēng)-3（見圖2），它通過兩個二硫鍵和蛋白質(zhì)上的兩個巰基連接，這種連接方式增加了標(biāo)簽的剛性，降低了順磁標(biāo)簽相對于蛋白質(zhì)的運(yùn)動。但是作者發(fā)現(xiàn)L-2和蛋白質(zhì)連接以后，滴加順磁金屬離子，HSQC中部分殘基有兩個順磁信號，說明標(biāo)簽和順磁金屬離子配位以后，存在不止一種構(gòu)象。