[發(fā)明專利]螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510031233.2
• 申請日: 2015-01-21
• 公開（公告）號: CN104561207B
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張學(xué)武;王竹君
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學(xué)
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K7/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

本發(fā)明提供螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法。該方法為：采用純水，通過反復(fù)凍融、均質(zhì)和超聲獲取螺旋藻全蛋白，通過堿性蛋白酶Alcalase 2.4和木瓜蛋白雙酶解的方法，獲取螺旋藻多肽，再利用超濾膜分離純化，獲得分子量大小范圍為0?3 K、3?5 K，5?10K以及大于10 K的螺旋藻多肽共4個組份。本發(fā)明得到的螺旋藻多肽和單肽組分，為抗腫瘤藥物和保健食品的開發(fā)利用奠定了理論基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法。

背景技術(shù)

生物活性肽是對機體的功能或狀態(tài)具有積極作用并最終影響機體健康的特殊蛋白質(zhì)片段。相較于蛋白質(zhì)而言，小分子肽片段的優(yōu)越性主要體現(xiàn)在：更易被人體吸收利用；活性高，在較小濃度下即可發(fā)揮其特有的生理作用；分子量小，易于修飾和改造，能夠通過人工化學(xué)合成等。而相較于單一的氨基酸而言，小分子肽除了具有特殊的生理活性外，在吸收通道和吸收速度上也具有氨基酸無可比擬的優(yōu)越性。已有研究證實，人體小腸存在專門的低聚肽吸收通道，人體攝入的蛋白質(zhì)經(jīng)過多種消化酶的水解，主要以低肽的形式被吸收，且二肽和三肽的吸收速度比同組成的氨基酸更快。

海洋環(huán)境復(fù)雜多變，其高鹽、高壓、低溫、寡營養(yǎng)等獨特條件賦予了海洋生物某些優(yōu)良的特性。許多研究表明，生物活性肽，尤其是海洋來源的生物活性肽具有抗氧化、抗腫瘤、抑菌、降壓、降血糖等多種作用。而近年來，海洋來源的天然生物抗腫瘤肽也取得一定的進(jìn)展，成為抗腫瘤藥物和保健品開發(fā)的重要來源。

螺旋藻（Spirulina）是人類迄今為止所發(fā)現(xiàn)的最優(yōu)質(zhì)的純天然蛋白質(zhì)食品源，其蛋白質(zhì)含量高達(dá)50－70%，由18種氨基酸組成，包含人體全部8種必需氨基酸，且配比合理。其豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸為開發(fā)螺旋藻生物活性肽提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)。利用酶解手段將螺旋藻蛋白進(jìn)行非變性水解，不僅能提高螺旋藻蛋白的溶解性和體內(nèi)吸收利用率，還能獲取具有特殊生理功能的生物活性肽。目前已有報道從螺旋藻蛋白酶解物中成功提取到抗氧化肽、ACE抑制肽、抑菌肽等，但抗腫瘤肽的研究尚處于初級階段。本文以MTT實驗為指導(dǎo)，通過酶解、超濾、凝膠色譜分離技術(shù)，純化得到多個抗腫瘤活性肽組分，并通過質(zhì)譜技術(shù)對其組分和序列進(jìn)行初步鑒定，為進(jìn)一步開發(fā)螺旋藻的食用和藥用價值提供理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容

為進(jìn)一步開發(fā)螺旋藻在食品和生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用價值，本發(fā)明的目的是提供一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用如下技術(shù)方案：

螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法，包括如下步驟：

（1）采用反復(fù)凍融、均質(zhì)和超聲聯(lián)用的方法，提取螺旋藻蛋白：取10~50 g螺旋藻粉，用超純水配制成濃度為5% (w/v)的溶液，反復(fù)凍融2~5次后，冰浴中均質(zhì)、超聲，離心取上清液，冷凍干燥，備用；

（2）取步驟（1）得到的螺旋藻蛋白配置成2~5%的蛋白液，加入堿性蛋白酶Alcalase2.4在控制條件下進(jìn)行酶解，使用0.05～0.2 mol/L的NaOH和HCl來調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH值，控制pH值在pH±0.05之間，酶解完后再調(diào)節(jié)酶解條件，加入木瓜蛋白酶在控制條件下進(jìn)行酶解，反應(yīng)體系的pH值控制方法同上，酶解完畢后滅酶，冷卻至室溫，將酶解液離心，取上清液；

（3）取步驟（2）得到的酶解液，依次用截留分子量分別為10 KD、5 KD以及3 KD的超濾膜過濾，從而獲得分子量大小范圍為0-3 KD、3-5 KD，5-10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液；

（4）取步驟（3）得到的0-3K的酶解液進(jìn)行葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析，水洗脫，按照出峰的時間順序，收集得到6個多肽組分，分別命名為D1、D2、D3、D4、D5和D6，即螺旋藻抗腫瘤多肽。