[發(fā)明專利]螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510031233.2
• 申請日: 2015-01-21
• 公開（公告）號: CN104561207B
• 公開（公告）日: 2018-07-20
• 發(fā)明（設計）人: 張學武;王竹君
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K7/06;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

1.一種螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法，其特征在于具體包括如下步驟：

（1）取10~50 g螺旋藻粉，用超純水配制成濃度為5% (w/v)的溶液，反復凍融2~5次后，冰浴中均質(zhì)、超聲，離心取上清液，冷凍干燥，備用；

（2）取步驟（1）得到的螺旋藻蛋白配置成2~5%的蛋白液，加入堿性蛋白酶Alcalase2.4在控制條件下進行酶解，使用0.05～0.2 mol/L的NaOH和HCl來調(diào)節(jié)反應體系的pH值，控制pH值在pH±0.05之間，酶解完后再調(diào)節(jié)酶解條件，加入木瓜蛋白酶在控制條件下進行酶解，反應體系的pH值控制方法同上，酶解完畢后滅酶，冷卻至室溫，將酶解液離心，取上清液；所述堿性蛋白酶Alcalase2.4與木瓜蛋白酶雙酶解的水解條件是：堿性蛋白酶酶解溫度40~60℃，pH=7~9，酶解時間4~8 h，酶與底物的濃度比為4~6%（w/w），然后加入木瓜蛋白酶酶解，酶解溫度40~60℃，pH=6~7，酶解時間2~4h，酶與底物濃度比為3~5%（w/w）；

（3）取步驟（2）得到的酶解液，依次用截留分子量分別為10 KD、5 KD以及3 KD的超濾膜過濾，從而獲得分子量大小范圍為0-3 KD、3-5 KD，5-10KD和大于10 KD的螺旋藻蛋白酶解液；

（4）取步驟（3）得到的0-3K的酶解液進行葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析，水洗脫，在一定的檢測波長下收集得到6個多肽組分，即螺旋藻抗腫瘤多肽；所述的葡聚糖凝膠Sephadex G-15分離純化，具體條件為：柱體積為150~200 mL，上樣量為1~4 mL，上樣濃度為50~150 mg/mL，流動相為水，流速為0.4 mL/min，每8 min收集一管，總共收集160管，檢測波長為280 nm；所述螺旋藻抗腫瘤多肽組份通過 MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析鑒定得到。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法，其特征在于，步驟（1）所述反復凍融條件為：-20 ℃冰箱中冷凍4~8h，再置于 37℃水浴中解凍2~3h；均質(zhì)條件為：樣品置于冰浴中均質(zhì)1~3min，轉(zhuǎn)速為在3000~5000rpm攪拌 20~50s，然后在7000~12000rpm攪拌 30~60s，最后在3000~5000rpm攪拌20~50s。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法，其特征在于，步驟（1）所述超聲條件為：樣品置于冰浴中，以460~670 W 的功率超聲20~15min，超聲過程中每超聲 4~8 s間隔 6~10 s后再超聲4~8 s間隔 6~10 s，如此重復進行。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法，其特征在于，步驟（1）所述離心條件為：4 ℃，8000 ~10000r/min，離心時間為 30 ~60min。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法，其特征在于，步驟（2）所述滅酶條件為：80~95℃水浴滅酶10~15 min。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的制備方法，其特征在于，步驟（2）所述離心條件為8000~10000 r/min，離心30~60 min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種螺旋藻抗腫瘤多肽的雙酶解制備方法，其特征在于，步驟（3）所述的超濾在CO₂壓力為0.1～0.25 MPa的室溫下用超濾杯結(jié)合10K，5K和3K的超濾膜超濾。