[發(fā)明專利]一種金錢龜抗腫瘤多肽的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510029499.3
• 申請日: 2015-01-21
• 公開（公告）號: CN104630318B
• 公開（公告）日: 2018-01-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張學武;何勝潔
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/34;A61K38/01;A23L33/18;A61P35/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司44102
• 代理人: 何淑珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種金錢龜抗腫瘤多肽的制備方法。

背景技術(shù)

金錢龜（Cuora Trifasciata）又名三線閉殼龜，具有極高的藥用價值。古代東漢時期《神農(nóng)本草經(jīng)》、戰(zhàn)國時期《山海經(jīng)》都有龜類食用藥用的記載；金錢龜對解毒、消炎、益肝、補腎效果明顯,常被用作保健養(yǎng)顏、防治腫瘤和長壽健體的主藥之一。金錢龜所含的活性因子較高，對于治療血小板減少，細胞敗死有一定的效果，并且可以抑制癌細胞的生長，促進人體中的血液循環(huán)。

生物活性肽（biologically active peptides, BAP）是一種具有特殊生理功能的小分子活性物質(zhì)，如抗腫瘤、抗菌、抗高血壓、抗病毒以及提高免疫力等，這些物質(zhì)廣泛存在于動物、植物以及微生物中。不同的生物活性肽其結(jié)構(gòu)有很大的差異，既有簡單的二肽又有復雜結(jié)構(gòu)的環(huán)肽和線肽，它們在體內(nèi)非常容易被消化吸收。生物活性肽主要有4種來源，分別為蛋白酶解多肽、微生物發(fā)酵代謝多肽、天然活性多肽以及化學合成多肽。其中酶解法不僅產(chǎn)量大、成本低、反應過程不會產(chǎn)生有害物質(zhì)而且此方法所得到的抗腫瘤多肽活性比較強，安全性相對比較高，所以成為了目前主要的活性肽合成方法。

由于近幾年來惡性腫瘤發(fā)病率的不斷提高，而傳統(tǒng)的化療藥物不僅毒副作用大而且治療效果并不理想，因此，生物活性肽憑借其活性高、副作用小、針對性強的優(yōu)勢得到了國內(nèi)外科研工作者的研究和關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種金錢龜抗腫瘤多肽的制備方法，以拓展金錢龜在食品和生物醫(yī)學領(lǐng)域的應用。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，采用如下技術(shù)方案：

一種金錢龜抗腫瘤多肽的制備方法，包括如下步驟：

（1）取3～20 g金錢龜肉糜和超純水混合后攪拌，配制成濃度為10～50% (w/v)的混合溶液，加入胰蛋白酶進行酶解，水解過程中使用0.05～0.2 mol/L的NaOH或HCl來調(diào)節(jié)反應體系的pH值，控制pH值在pH±0.05之間，酶解完畢后滅酶，冷至室溫，將酶解液離心，取上清液；

（2）取步驟（1）得到的酶解液，依次用截留分子量分別為10 KD、5 KD以及3 KD的超濾膜過濾，從而獲得分子量大小范圍為0-3 KD、3-5 KD和大于10 KD的金錢龜多肽的酶解液；

（3）取步驟（2）得到的0-3K的酶解液進行葡聚糖凝膠Sephadex G-15柱層析，水洗脫，按照出峰的時間順序，分別收集得到4個多肽組份分別命名為E1、E2、E3和E4，即金錢龜抗腫瘤多肽。

上述方法中，步驟（1）中，所述胰蛋白酶水解條件是：pH=7～9，酶解溫度30～60℃，酶解時間4～15 h，酶與底物濃度比為0.1%～0.5%（w/w）。

上述方法中，步驟（1）所述滅酶為在80～100℃水中滅酶10～20 min。

上述方法中，步驟（1）所述離心為在6000～10000 r/min下離心30～60 min。

上述方法中，步驟（2）所述的超濾在CO₂的壓力為0.1～0.25 Mpa的室溫下用超濾杯結(jié)合超濾膜超濾。

上述方法中，步驟（3）所述的葡聚糖凝膠Sephadex G-15分離純化，具體條件為：柱體積為100～200 mL，上樣量為1～4 mL，上樣濃度為20～150 mg/mL，流動相為水，流速為0.3 mL/min，每4 min收集一管，總共收集110管，檢測波長為218 nm。

上述方法中，步驟（3）所述金錢龜抗腫瘤多肽組份中E1和E2經(jīng) MALDI-TOF-TOF質(zhì)譜分析鑒定得到其中三條肽序列為PGVKGPR、SSPGPPVH和KLGPKGPR。

與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的技術(shù)優(yōu)點和效果：