[發(fā)明專(zhuān)利]一種法氏囊病毒效價(jià)的測(cè)定方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510027662.2
• 申請(qǐng)日: 2015-01-20
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104630385A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江興華
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 福州大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/70
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/70;C12R1/93
• 代理公司: 福州君誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35211
• 代理人: 戴雨君

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種法氏囊病毒效價(jià)的測(cè)定方法。

背景技術(shù)

一般法氏囊病毒效價(jià)的測(cè)定流程包括：細(xì)胞傳代，鋪細(xì)胞板，病毒稀釋?zhuān)?xì)胞板換液并加病毒液培養(yǎng)，病變觀察及結(jié)果的判定。

傳統(tǒng)方法，細(xì)胞消化后按1：3的傳代分種比例的細(xì)胞來(lái)鋪板，細(xì)胞板培養(yǎng)96小時(shí)后，以70％的細(xì)胞病變作為判定標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算病毒效價(jià)。這種方法的缺陷在于：每次固定傳代比例的細(xì)胞密度存在較大的差異，當(dāng)原方瓶細(xì)胞密度大，消化后的細(xì)胞密度也大，所以鋪板的細(xì)胞密度就大，培養(yǎng)24小的細(xì)胞密度差異就會(huì)較大，而細(xì)胞密度會(huì)影響病毒效價(jià)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。一般來(lái)說(shuō)，每個(gè)細(xì)胞有個(gè)最小病毒感染量，病毒效價(jià)測(cè)定過(guò)程中，每細(xì)胞孔接種的毒量是一定的，按傳統(tǒng)的方法每次細(xì)胞板中每孔的細(xì)胞量差異較大，而判定仍是按細(xì)胞病變70％來(lái)計(jì)算，當(dāng)細(xì)胞數(shù)量差異大時(shí)，細(xì)胞病變至70％的孔數(shù)差別就很大，判定的結(jié)果差異就很大，就存在同樣的樣品每次測(cè)定結(jié)果都不一樣，而且差異較大。另一方面，以70％的細(xì)胞病變作為判定標(biāo)準(zhǔn)，存在較大的人為的判定差異，不能真正反應(yīng)樣品的效價(jià)，難以做到標(biāo)準(zhǔn)化。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種提高測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性與穩(wěn)定性的法氏囊病毒效價(jià)的測(cè)定方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種法氏囊病毒效價(jià)的測(cè)定方法，包括以下步驟：

1)細(xì)胞傳代：將要用于鋪板的培養(yǎng)48小時(shí)的方瓶細(xì)胞倒去培養(yǎng)液，用磷酸鹽緩沖液(PBS)將細(xì)胞洗兩遍后，加入質(zhì)量濃度為0.25％的胰酶消化液進(jìn)行消化，然后加入與倒去的培養(yǎng)液等體積的營(yíng)養(yǎng)液，用移液管吹打混合均勻，得到細(xì)胞原液；

2)消化后細(xì)胞原液細(xì)胞計(jì)數(shù)及細(xì)胞原液的最終稀釋?zhuān)簩⒉骄?)的細(xì)胞原液取出一部分，稀釋后，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行計(jì)數(shù)，并換算出細(xì)胞原液的密度；

再根據(jù)細(xì)胞原液的密度，將細(xì)胞原液用營(yíng)養(yǎng)液稀釋至細(xì)胞密度為2-3×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml的細(xì)胞稀釋液，待用；

3)鋪細(xì)胞板并培養(yǎng)：將上述細(xì)胞稀釋液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞稀釋液100ul(即每孔含2-3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞)，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，待用；

4)病毒的稀釋?zhuān)喝》ㄊ夏也《疽海貌缓宓臓I(yíng)養(yǎng)液逐步稀釋?zhuān)玫?0^-6，10^-7，10^-8的法氏囊病毒稀釋液；

5)細(xì)胞板換液并加病毒液培養(yǎng)觀察：將步驟3)中培養(yǎng)24h的96孔細(xì)胞培養(yǎng)板倒去廢液，然后將10^-6，10^-7，10^-8的法氏囊病毒稀釋液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個(gè)稀釋度加6孔，每孔100ul，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板置于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)96h；

6)細(xì)胞病變觀察及結(jié)果判定：上述細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)96h后，觀察細(xì)胞病變，以100％的細(xì)胞病變作為判定標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算病毒效價(jià)TCID₅₀/0.1mL。

所述的步驟1)中胰酶消化液的質(zhì)量濃度為0.25-0.3％。

所述的步驟1)加入的胰酶消化液完全浸沒(méi)細(xì)胞。

所述的步驟2)具體為：取步聚1)的細(xì)胞原液1-1.5ml，稀釋3-5倍，然后用移液槍吸取30-35ul稀釋后的細(xì)胞原液，加入細(xì)胞計(jì)數(shù)板中進(jìn)行計(jì)數(shù)，并換算出細(xì)胞原液的密度，再根據(jù)細(xì)胞原液的密度，及加入細(xì)胞板的密度(每孔加100ul，含2-3萬(wàn)個(gè)細(xì)胞，即密度為2-3×10⁵個(gè)細(xì)胞/ml)進(jìn)行稀釋?zhuān)♂尯玫募?xì)胞稀釋液待用。

所述營(yíng)養(yǎng)液是指DMEM(含各種氨基酸和葡萄糖的培養(yǎng)基)粉末，加注射用水配制后過(guò)濾，用時(shí)再添加10％的血清而成。

病毒稀釋所用的營(yíng)養(yǎng)液，不加血清，因?yàn)檠鍟?huì)影響法氏囊病毒吸附到細(xì)胞上，影響病毒侵入細(xì)胞及后續(xù)的細(xì)胞繁殖。

所述TCID₅₀/0.1mL的計(jì)算方法按《中化人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》中病毒半數(shù)致死(感染)量(LD50、EID50、TCID50)的測(cè)定方法。