[發明專利]一種畢赤酵母菌基因工程雜合抗菌肽CC29及其獲得方法

在審

• 申請號: 201510027047.1
• 申請日: 2015-01-16
• 公開（公告）號: CN104788568A
• 公開（公告）日: 2015-07-22
• 發明（設計）人: 張愛忠;姜寧;張晨雪;蔡鵬;朱雙;劉曉明;祁麗
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/81
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及基因工程和生物技術領域，具體涉及一種畢赤酵母菌基因工程雜合抗菌肽CC29及其獲得方法。

背景技術

抗菌肽是生物先天性免疫系統的重要組成部分，是經免疫誘導產生的一類抵抗外界病原體感染具有生物活性的小分子多肽?？咕木哂袕V譜抗菌作用，尤其是對一些產生抗生素耐藥性的病原菌的殺滅作用更引起了人們對它的興趣?？咕脑谵r業、醫療、食品等領域的應用潛力巨大。迄今為止，已經發現了上千種天然抗菌肽，但是具有較好的醫療選擇指數的種類卻比較少，因此，如何能夠獲得抑菌效果好、產量高的抗菌肽一直受到研究者的普遍關注。目前，抗菌肽的獲得方法主要有三種：(1)直接從生物體中提取天然肽，但含量非常少，且提取工藝復雜，成本較高，難以滿足大規模生產的要求；(2)化學方法合成。這種方法只適用于非常短的抗菌肽，但大多數抗菌肽分子量都比較大，不適合化學合成；(3)分子量比較大的抗菌肽大多都采用基因工程的方法，該方法研究的比較透徹，而且是生產抗菌肽的有效途徑。因此，人們希望通過分子上的重新設計，例如，雜合肽的設計等方式從豐富的天然抗菌肽資源中獲得理想的新型人工抗菌肽。

雜合抗菌肽的設計特點是集兩個(或以上)天然肽的優點于一身，經過適當的人工修飾后，可以揚長避短，最大程度上發揮抗菌活性，并不引起溶血。天蠶素抗菌肽(cecropins)是目前研究最清楚、效果最好的天然抗菌肽；家蠅天蠶素抗菌肽(Cec?Md)是本實驗室經誘導家蠅幼蟲，然后克隆得到的(同源性81％)。而Chensirin是近年來發現的中國東北林蛙皮膚上分泌的天然抗菌肽，其活性很高，但具有較高的溶血活性。如果能夠對兩者進行雜合設計，將會為抗菌肽的規?；a奠定基礎。

發明內容

為解決上述問題，本發明提供了一種畢赤酵母菌基因工程雜合抗菌肽CC29及其獲得方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

一種畢赤酵母菌基因工程雜合抗菌肽CC29，所述抗菌肽CC29包括兩對引物，其核苷酸序列為：

CCGTTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAGGCTGGTCAACACACTTTGTTGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCTAAGAAGACTCTAG

所述核苷酸序列前端引入三肽序列(波浪線部分)，方便后期標簽蛋白的切割，所述核苷酸序列兩端各加入了BamH?I和Sal?I限制性內切酶位點(方框內)和保護性堿基(兩尾端)，末端加上終止密碼子(TAA)。下劃線部分為家蠅天蠶素抗菌肽Cec?Md的部分成熟肽基因序列，未劃線部分為Chensirin部分成熟肽基因序列

所述抗菌肽CC29的分子量為3236.00；電荷數為+7.5；等電點為11.22；疏水力矩為0.35。

上述的一種畢赤酵母菌基因工程雜合抗菌肽CC29通過以下方法獲得：

S1、根據Genbank中Chensirin序列(登錄號ABI95142、ABF13216、ABF13217、ABG66418)以及實驗室克隆得到的家蠅天蠶素抗菌肽序列(GWLKKIGKKIERVGQHTRDATUQTIGVAQQAANVAATLKG)，選取具有潛力的片段進行組合，應用生物信息學工具計算各組合的一級特征參數、預測二級和三級結構和抗菌活性，篩選出醫療潛力指數最大的組合CC29，在其兩端加上Xho?I和Xba?I限制性內切酶位點和保護性堿基，末端加上終止密碼子，合成兩對引物F1、R1，F2、R2，應用重疊PCR技術合成CC29融合蛋白基因；它的兩對引物序列為：

F1為5’-CCGCTCGAGAAAAGAGGTTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAG-3’，

R1為5’-GGCAACAAAGTGTGTTGACCAGCCTTCAACTTCTTACCCAAC-3’，

F2為5’-GCTGGT?CAACACACTTTGTTGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCT-3’，

R2為5’-CTAGTCTAGATTAAGTCTTCTTAGCGAAGTAACCCAATGGC-3’。

F1與R1，F2與R2分別進行延伸，得到延伸液F1R1、F2R2，然后進行第二次PCR延伸，此時延伸液F1R1與F2R2互為模板與引物。