[發明專利]一種畢赤酵母菌基因工程雜合抗菌肽CC29及其獲得方法

在審

• 申請號: 201510027047.1
• 申請日: 2015-01-16
• 公開（公告）號: CN104788568A
• 公開（公告）日: 2015-07-22
• 發明（設計）人: 張愛忠;姜寧;張晨雪;蔡鵬;朱雙;劉曉明;祁麗
• 申請（專利權）人: 黑龍江八一農墾大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/81
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種畢赤酵母菌基因工程雜合抗菌肽CC29，其特征在于，所述抗菌肽CC29包括兩對引物，其核苷酸序列為：

CCGTTGGTTGAAGAAGTTGGGTAAGAAGTTGAAGGCTGGTCAACACACTTTGTTGCCATTGCCATTGGGTTACTTCGCTAAGAAGACTCTAG

所述核苷酸序列前端引入三肽序列，所述核苷酸序列兩端各加入了BamH?I和Sal?I限制性內切酶位點和保護性堿基，末端加上終止密碼子，所述抗菌肽CC29的分子量為3236.00；電荷數為+7.5；等電點為11.22；疏水力矩為0.35。

2.一種畢赤酵母菌基因工程雜合抗菌肽CC29的獲得方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、根據Genbank中Chensirin序列以及實驗室克隆得到的家蠅天蠶素抗菌肽序列，選取具有潛力的片段進行組合，應用生物信息學工具計算各組合的一級特征參數、預測二級和三級結構和抗菌活性，篩選出醫療潛力指數最大的組合CC29，在其兩端加上Xho?I和Xba?I限制性內切酶位點和保護性堿基，末端加上終止密碼子，合成兩對引物F1、R1，F2、R2，應用重疊PCR技術合成CC29融合蛋白基因；

S2、構建CC29克隆載體、pGAPZαA/CC29并測序鑒定，構建表達載體pGAPZαA/CC29并測序鑒定，將重組的克隆pGAPZαA/CC29與表達載體pGAPZαA同時雙酶切，獲得的目的基因與同樣酶切的表達載體連接構建重組表達載體pGAPZαA/CC29，將雜合抗菌肽CC29表達載體轉化到宿主菌SMD1168中，獲得雜合抗菌肽CC29的重組原核表達基因工程菌；

S3、使用IPTG對培養至對數期的雜合抗菌肽CC29大腸桿菌基因工程菌進行誘導，通過SDS-PAGE和western?blot技術對CC29融合蛋白進行檢測，以便確定其表達水平和表達方式；

S4、將雜合抗菌肽基因構建在畢赤酵母表達載體pGAPZαA上，電轉化到宿主菌SMD1168后，使用YPD液體培養基培養3天，雜合抗菌肽表達出分泌蛋白；對表達載體表達出的蛋白進行層析純化，純化后的融合蛋白經甲酸切割后去除標簽，然后進行定量，純化樣品保留；

S5、CC29的生物學活性鑒定。

3.根據權利要求2所述的一種畢赤酵母菌基因工程雜合抗菌肽CC29的獲得方法，其特征在于，所述步驟S5過程中包括：將雜合抗菌肽CC29經沸水浴2min、5min、10min、30min和60min的熱穩定性檢測；將雜合抗菌肽CC29在pH為1、2、5、7、10、12、14緩沖液中，以沙門氏菌為指示菌的殺菌活性檢測；通過抑菌圈法和連續倍比稀釋法測定雜合抗菌肽CC29對大腸桿菌、乳酸桿菌、雞沙門氏菌、停乳鏈球菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性和最小抑菌濃度；采用紅細胞血紅素的釋放測定雜合抗菌肽CC29的溶血活性。