[發明專利]一種檢測雌激素或類雌激素化合物濃度的方法

有效

• 申請號: 201510025917.1
• 申請日: 2015-01-19
• 公開（公告）號: CN105866441B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 王子健;楊蓉;李娜;饒凱鋒;馬梅
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,陳曉慶

技術領域

本發明涉及一種檢測雌激素或類雌激素化合物濃度的方法，屬于生物技術領域。

背景技術

雌激素受體干擾物是內分泌干擾物研究的熱點之一，水環境中的雌激素受體干擾物包括來源于各種渠道的天然雌激素和其他類/抗雌激素物質。它們在較低的暴露濃度下就會造成生物體的不良影響，而環境中的聯合暴露往往意味著加和甚至相互作用的可能性。因此監測雌激素受體干擾物的環境水平及其對生物的不良影響是非常重要的。

許多機構和組織——包括美國環境署、美國健康與公共事業部、經濟合作與發展組織等——都提出了檢測雌激素效應的生物測試方法清單。與化學分析相比，生物檢測方法可以提供雌激素誘導/拮抗效應的整體信息，也更利于綜合判斷和毒性評估。雌激素受體在雌激素效應的發揮上起到重要作用，因此清單中大多數方法都與雌激素受體相關，鼓勵使用受體方法檢測雌激素類物質。其中，雙雜交技術重組人雌激素受體的酵母測試方法已被應用于各種環境水樣的檢測，具有靈敏度高、重現性好、操作簡便、成本低廉等優點。共激活因子的引入使雙雜交酵母與活體測試結果有更好的吻合度。例如，單雜交酵母測試結果顯示合成雌激素17α-乙炔基雌二醇的雌激素效應弱于天然雌激素17β-雌二醇(Van den Belt K,et al.Aquat.Toxicol.2004,66(2):183-195)；但虹鱒和雙雜交酵母作為受試生物時，17α-乙炔基雌二醇的雌激素效應都被證明比17β-雌二醇更強(Thorpe KL,et al.Environ Sci Technol.2003,37(6):1142-1149；Yang R,et al.Environ.Toxicol.Pharmacol.2014,38(3):829-837)。

上述雙雜交酵母測試的工作原理是：天然或環境雌激素可與雌激素受體結合并導致其構象改變，此時的配體—受體復合物可在細胞核內進一步結合共激活因子，啟動下游報告基因的轉錄。然而，雌激素受體拮抗物的存在會干擾這一過程，從而造成對雌激素誘導效應的測試結果的低估。目前，研究多集中在(類)雌激素混合物的聯合作用上，而較少關注類雌激素和雌激素受體拮抗物的聯合作用。但在某些環境樣品中(如醫院廢水、藥廠廢水等)，雌激素受體拮抗物可以達到較高的濃度，其造成的效應需要研究者給予重視。這時，生物測試結果描述的是兩類物質共同作用的聯合效應，而不能利用此效應大小反推真實的雌激素物質水平。因此，對這種干擾甚至掩蔽作用加以關注和評估在污染物毒性評價方面具有現實意義。

綜上所述，真實環境中有復雜的類雌激素和雌激素受體拮抗物共同存在。在某些廢水中高濃度的雌激素受體拮抗物足以影響生物測試方法對雌激素效應的檢測，但這一點在實際研究中較少受到關注，相關信息和結果較少。因此，需要建立一種方法計算并修正化學混合物及環境樣品(可看作復雜混合物)中的雌激素受體拮抗物對使用雙雜交酵母方法檢測出的雌激素受體誘導效應的干擾。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是檢測樣品中的天然雌激素化合物或類雌激素化合物的濃度。

為了解決以上技術問題，本發明提供一種檢測樣品中具有雌激素效應的化合物濃度的方法，包括如下步驟：

(1)建立雌激素化合物的濃度—雌激素效應關系曲線，包括如下步驟：

A1、制備雙雜交酵母菌處于對數生長期的雙雜交酵母菌液；

B1、將雌激素化合物溶液與步驟A1的雙雜交酵母菌液按照同一體積比混勻，制備成雌激素化合物各暴露液，使得雌激素化合物各暴露液中的所述雙雜交酵母菌含量均相同，雌激素化合物含量均不同；將二甲基亞砜與步驟A1的雙雜交酵母菌液混勻，制備成二甲基亞砜暴露液，使得二甲基亞砜暴露液中的所述雙雜交酵母菌含量與所述雌激素化合物各暴露液中的所述雙雜交酵母菌含量相同；將所述雌激素化合物各暴露液和所述二甲基亞砜暴露液分別進行相同的暴露培養，對應得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亞砜暴露后溶液，檢測所述雌激素化合物各暴露后溶液在600nm處的吸光度值OD₆₀₀；

C1、分別取所述雌激素化合物各暴露后溶液或所述二甲基亞砜暴露后溶液，向其中加入測試緩沖液、三氯甲烷和β-半乳糖苷酶底物溶液，反應，再加入碳酸鈉水溶液中止反應，得到對應的雌激素化合物各中止反應溶液和二甲基亞砜中止反應溶液，分別取其上清液檢測420nm處的吸光度值OD₄₂₀，按照公式1對應得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亞砜暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性：