[發明專利]一種檢測雌激素或類雌激素化合物濃度的方法

有效

• 申請號: 201510025917.1
• 申請日: 2015-01-19
• 公開（公告）號: CN105866441B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 王子健;楊蓉;李娜;饒凱鋒;馬梅
• 申請（專利權）人: 中國科學院生態環境研究中心
• 主分類號: G01N33/74
• 分類號: G01N33/74
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司11245
• 代理人: 關暢,陳曉慶

1.一種檢測樣品中具有雌激素效應的化合物濃度的方法，包括如下步驟：

（1）建立雌激素化合物的濃度—雌激素效應關系曲線，包括如下步驟：

A1、制備雙雜交酵母菌處于對數生長期的雙雜交酵母菌液；

B1、將雌激素化合物溶液與步驟A1的雙雜交酵母菌液按照同一體積比混勻，制備成雌激素化合物各暴露液，使得雌激素化合物各暴露液中的所述雙雜交酵母菌含量均相同，雌激素化合物含量均不同；將二甲基亞砜與步驟A1的雙雜交酵母菌液混勻，制備成二甲基亞砜暴露液，使得二甲基亞砜暴露液中的所述雙雜交酵母菌含量與所述雌激素化合物各暴露液中的所述雙雜交酵母菌含量相同；將所述雌激素化合物各暴露液和所述二甲基亞砜暴露液分別進行相同的暴露培養，對應得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亞砜暴露后溶液，檢測所述雌激素化合物各暴露后溶液在600nm處的吸光度值OD₆₀₀；

C1、分別取所述雌激素化合物各暴露后溶液或所述二甲基亞砜暴露后溶液，向其中加入測試緩沖液、三氯甲烷和β-半乳糖苷酶底物溶液，反應，再加入碳酸鈉水溶液中止反應，得到對應的雌激素化合物各中止反應溶液和二甲基亞砜中止反應溶液，分別取其上清液檢測420nm處的吸光度值OD₄₂₀，按照公式1對應得到雌激素化合物各暴露后溶液和二甲基亞砜暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性：

U = (OD_420s ? OD_420b) × D / (t × V × OD₆₀₀)（公式1）

公式1中， U為暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性；

OD_420s為雌激素化合物各中止反應溶液的上清液在420nm處的吸光度值；

OD_420b為二甲基亞砜中止反應溶液的上清液在420nm處的吸光度值；

D為稀釋因子，即雌激素化合物中止反應溶液的體積與步驟C1所取的雌激素化合物各暴露后溶液的體積比，將該體積比命名為D_雌；或，二甲基亞砜中止反應溶液的體積與步驟C1所取的二甲基亞砜暴露后溶液的體積比，將該體積比命名為D_砜；所述D_雌等于D_砜；

t為從加入所述測試緩沖液、三氯甲烷和β-半乳糖苷酶底物溶液后至加入碳酸鈉水溶液中止反應之間的時間；

V為檢測420nm處的吸光度值OD₄₂₀時所取的上清液體積；

OD₆₀₀為雌激素化合物各暴露后溶液在600nm處的吸光度值；

D1、按照公式2得到雌激素化合物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性參數的誘導率：

誘導率% = U_s / U_p × 100（公式2）

公式2中，U_s 和U_p分別為雌激素化合物各暴露后溶液和陽性對照的β-半乳糖苷酶活性；

所述陽性對照為雌激素化合物含量為K的雌激素化合物暴露液經所述暴露培養后得到的暴露后溶液，雌激素化合物含量為K的雌激素化合物暴露液是將雌激素化合物溶液與步驟A1的雙雜交酵母菌液按同一體積比混勻得到的液體；K為以雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量為橫坐標，以公式1得到的雌激素化合物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性為縱坐標，制成的雌激素化合物的濃度—β-半乳糖苷酶活性曲線的第二個拐點處對應的雌激素化合物的濃度；

E1、以所述雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量為橫坐標，以公式2得到的雌激素化合物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性參數的誘導率為縱坐標，制作雌激素化合物的濃度—雌激素效應關系曲線，并得到如下公式3：

E_induction = f_E(x_E2)（公式3）

公式3中，E_induction為雌激素化合物各暴露后溶液的的β-半乳糖苷酶活性參數的誘導率；

f_E 中的下標_E代表雌激素；

x_E2為所述雌激素化合物各暴露液的雌激素化合物含量；

（2）檢測待測樣品的β-半乳糖苷酶活性參數的誘導率，包括如下步驟：

根據步驟（1）得到待測樣品的β-半乳糖苷酶活性參數的誘導率；

（3）得到待測樣品的雌二醇當量E2-EQ_bio，包括如下步驟：

采用公式9得到待測樣品的雌二醇當量E2-EQ_bio：

E2-EQ_bio = f_E^-1 (E_induction) / cf（公式9）

公式9 中f_E^-1 (E_induction)為公式3的反函數；

f_E^-1中的下標_E代表雌激素；

E_induction為待測樣品的β-半乳糖苷酶活性參數的誘導率；

cf為待測樣品到原始樣品的濃縮倍數；

（4）確定待測樣品的雌激素受體拮抗物當量OHT-EQ_bio，包括如下步驟：

A4、建立雌激素受體拮抗物的濃度—雌激素受體拮抗效應關系曲線，建立雌激素受體拮抗物的濃度—雌激素受體拮抗效應關系曲線的方法與步驟（1）的建立雌激素化合物的濃度—雌激素效應關系曲線的方法區別僅在于將雌激素化合物替換為雌激素受體拮抗物；

B4、按照公式4得到雌激素受體拮抗物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性參數的抑制率：

抑制率% = (1 – U_s / U_p) × 100（公式4）

公式4中，U_s 和U_p分別為雌激素受體拮抗物各暴露后溶液和陽性對照的β-半乳糖苷酶活性；

C4、以雌激素受體拮抗物各暴露液的雌激素受體拮抗物含量為橫坐標，以公式4得到的雌激素受體拮抗物各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性參數的抑制率為縱坐標，制作雌激素受體拮抗物的濃度—雌激素受體拮抗效應關系曲線，并得到如下公式5：

E_inhibition = f_O(x_OHT)（公式5）

公式5中，E_inhibition為β-半乳糖苷酶活性參數的抑制率；

f₀ 中的下標₀代表雌激素受體拮抗物；

x_OHT為雌激素受體拮抗物各暴露液的雌激素受體拮抗物含量；

D4、將雌激素化合物溶液A和待測樣品共同替換步驟（1）中的雌激素化合物溶液，作為混合組，雌激素化合物溶液A與混合組暴露液中的雙雜交酵母菌液的體積比與待測樣品與混合組暴露液中的雙雜交酵母菌液的體積比相同，且均與步驟（1）B1中的所述體積比一致，混合組暴露液中的雌激素化合物在加入雌激素化合物溶液A而未加待測樣品時的暴露液中的濃度與所述陽性對照對應的雌激素化合物暴露液中的雌激素化合物濃度相同，其余步驟不變，按照步驟（1）得到混合組各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性；

E4、按照公式4得到混合組各暴露后溶液的β-半乳糖苷酶活性參數的抑制率；

F4、采用公式11得到待測樣品的雌激素受體拮抗物當量OHT-EQ_bio：

OHT-EQ_bio = f_O^-1 (E_inhibition) / cf（公式11）

公式11中，f_O^-1 (E_inhibition)為公式5的反函數；

f₀ 中的下標₀代表雌激素受體拮抗物；

E_inhibition為待測樣品的β-半乳糖苷酶活性參數的抑制率；

cf為待測樣品到原始樣品的濃縮倍數；

（5）利用公式12對E2-EQ_bio進行修正，得到修正后待測樣品中具有雌激素效應的化合物的濃度：

E2-EQ_bio*= {EC₅₀(OHT) × E2-EQ_bio + [(EC₅₀(OHT) × E2-EQ_bio)^2 + 4 × EC₅₀(E2) × EC₅₀(OHT) × E2-EQ_bio ×OHT-EQ_bio]^0.5} / 2 × EC₅₀(OHT)（公式12）

公式12中，EC₅₀(OHT)為步驟（4）中C4得到的雌激素受體拮抗物的濃度—雌激素受體拮抗效應關系曲線的雌激素受體拮抗物的半數效應濃度，EC₅₀(E2)為步驟（1）得到的雌激素化合物的濃度—雌激素效應關系曲線的雌激素化合物的半數效應濃度；

所述雙雜交酵母為發明名稱為“用于檢測環境中類雌激素化合物的雙雜交酵母以及生物測試方法”，授權公告號為 CN101469315B的發明專利中權利要求1-3任一所述的雙雜交酵母；

所述測試緩沖液由溶劑和溶質組成，溶劑為水，溶質為Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·H₂O、KCl、MgSO₄·7H₂O、十二烷基磺酸鈉和β-巰基乙醇；所述Na₂HPO₄·7H₂O在所述測試緩沖液中的濃度為16.1 g/L ，所述NaH₂PO₄·H₂O在所述測試緩沖液中的濃度為5.5 g/L，所述KCl在所述測試緩沖液中的濃度為0.75 g/L，所述MgSO₄·7H₂O在所述測試緩沖液中的濃度為0.246 g/L，所述十二烷基磺酸鈉在所述測試緩沖液中的濃度為0.333 g/L，所述β-巰基乙醇在所述測試緩沖液中的濃度為2.7 mL/L；

所述β-半乳糖苷酶底物溶液由溶劑和溶質組成，溶劑為水，溶質為鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷、Na₂HPO₄·7H₂O、NaH₂PO₄·H₂O、KCl和MgSO₄·7H₂O；所述鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷在所述含有過量鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反應液中的濃度為13.3mmol/L、所述Na₂HPO₄·7H₂O在所述含有過量鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反應液中的濃度為16.1 g/L、所述NaH₂PO₄·H₂O在所述含有過量鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反應液中的濃度為5.5 g/L、所述KCl在所述含有過量鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反應液中的濃度為0.75 g/L、所述MgSO₄·7H₂O在所述含有過量鄰硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷的反應液中的濃度為0.246 g/L。