[發(fā)明專利]一種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510024575.1
• 申請日: 2015-01-18
• 公開（公告）號: CN104610450B
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 盛望;張瀟;白玉;趙淼;曾毅;李澤琳;劉偉
• 申請（專利權(quán)）人: 北京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/63;C12N5/10;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 北京思海天達(dá)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司11203
• 代理人: 劉萍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種識別腸道病毒71型及柯薩奇病毒A16型VP4蛋白的單克隆抗體及其制備方法與應(yīng)用，特別涉及一種將EV71VP4蛋白嵌合到HBcAg病毒樣顆粒中制備而成的融合蛋白，將其作為抗原免疫Balb/c小鼠。利用噬菌體展示抗體文庫技術(shù)篩選獲得能特異性中和EV71VP4蛋白的單克隆抗體。

背景技術(shù)

手足口病(Hand foot mouth disease，HFMD)是由不同的腸道病毒所引起的嬰幼兒常見的傳染病，以發(fā)熱和手、足、口等部位出現(xiàn)皰疹為特征，少數(shù)患兒出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷、肺水腫、肺出血、循環(huán)衰竭及心臟損害，個別因嚴(yán)重并發(fā)癥致死。近幾十年來，手足口病已在全世界多個地區(qū)爆發(fā)和流行，累及地區(qū)之廣，發(fā)病人數(shù)之多，引起人們高度重視。2008年1月1日至2011年10月31日止，全國感染手足口病近476萬例，造成1821名患兒死亡。在2008年我國將手足口病列入法定報告管理的丙類傳染病，要求在24h之內(nèi)上報衛(wèi)生部。引起手足口病的腸道病毒分為腸道病毒71(Enterovirus 71，EV71)、埃可病毒(ECHO)、柯薩奇病毒(Coxsackievirus)A型與B型等，其中以EV71及CVA16型最為常見。通常情況下，EV71與CVA16引起的手足口病在臨床癥狀等方面難以區(qū)別，但EV71易致無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣麻痹等多種神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)性疾病，可危及生命。

腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)屬于小RNA病毒科(Picornaradae)腸道病毒屬(Enterovirus)，分子量約為2.6×10⁶D，約由7389～7408個核苷酸組成的。柯薩奇病毒A16型(Coxsackievirus A16，CVA16)亦屬于小RNA病毒科，病毒基因組為約7410b的單鏈RNA。EV71與/或CVA16毒粒為二十面體形，立體對稱，呈球形狀，是裸露的核衣殼，直徑約為23-30nm，無包膜。

EV71與/或CVA16病毒的衣殼蛋白由VP1、VP2、VP3和VP4組成，四種結(jié)構(gòu)蛋白中，VP1、VP2和VP3裸露于病毒顆粒的表面，而VP4則位于病毒顆粒衣殼的內(nèi)表面與RNA核心緊密相連。根據(jù)病毒衣殼蛋白VP1核苷酸序列的 不同，可將EV71分為A、B、C三個基因型，其中B型分為B1-B5亞型，C型分為C1-C4亞型，不同亞型感染后臨床癥狀不完全相同。傳統(tǒng)意義上認(rèn)為病毒的抗原決定簇基本上位于VP1-VP3上(Cardosa M J,Perera D,Brown B A,et al.Molecular epidemiology of humanenterovirus 71strains and recent outbreaks in the Asia-Pacific region:comparative analysis of the VP1and VP4genes[J].Emerg Infect Dis,2003,9(4):461-468.)。有研究發(fā)現(xiàn)EV71VP4序列N-末端的前20個氨基酸是高度保守的，該段基因融合HBcAg形成的嵌合病毒樣顆粒(命名為HBcAg-VP4)有中和活性的產(chǎn)生，并且能夠引起針對不同EV71基因型以及CVA16的交叉中和抗體反應(yīng)。