[發明專利]一種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體的制備方法

有效

• 申請號: 201510024575.1
• 申請日: 2015-01-18
• 公開（公告）號: CN104610450B
• 公開（公告）日: 2017-09-29
• 發明（設計）人: 盛望;張瀟;白玉;趙淼;曾毅;李澤琳;劉偉
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C12N15/63;C12N5/10;A61K39/42;A61P31/14
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司11203
• 代理人: 劉萍

1.一種中和腸道病毒71型嵌合單克隆抗體或其片段，其特征在于：所述的單克隆抗體或其片段的輕鏈可變區具有SEQ ID NO：1所示的基因序列，

所述的單克隆抗體或其片段的重鏈可變區具有SEQ ID NO：2所示的基因序列，

所述的單克隆抗體或其片段包括可變區和恒定區，所述恒定區的人IgG1kappa輕鏈恒定區具有SEQ ID NO：3所示的基因序列；所述恒定區的人IgG1重鏈恒定區具有SEQ ID NO：4所示的基因序列。

2.根據權利要求1所述的單克隆抗體或其片段，其特征在于：

所述的單克隆抗體或其片段包括ScFv或Fab形式。

3.一種制備如權利要求1所述的單克隆抗體或其片段的方法，其特征在于步驟如下：

1)針對EV71VP4蛋白N-末端的前20個氨基酸序列融合HBc蛋白形成嵌合病毒樣顆粒，命名為HBcAg-VP4蛋白；利用已經獲得的HBcAg-VP4蛋白免疫6-8周齡的Balb/c小鼠，取小鼠脾臟組織，研磨得到細胞，分離淋巴細胞，Trizol法提取mRNA；

2)將步驟1)提取的mRNA反轉錄成cDNA，PCR反應擴增抗體可變區的輕鏈基因片段V_L與重鏈基因片段V_H，并利用重疊PCR拼接成V_L-Linker-V_H形式的ScFv單鏈抗體基因片段，經Sfi I和Not I雙酶切后插入到噬菌粒載體pCANTAB5E中，連接獲得重組質粒pCANTAB5E-ScFv，轉化TG1感受態細菌；

3)將步驟2)中已轉入重組質粒pCANTAB5E-ScFv的TG1細菌繼續擴大培養，加入M13K07輔助噬菌體，組裝并釋放能夠在噬菌體表面融合表達ScFv單鏈抗體片段的噬菌體，即噬菌體展示文庫；利用ELISA法，得到與EV71-C4型病毒抗原蛋白結合的噬菌體展示文庫，即陽性噬菌體展示文庫，其表面展示了具有中和EV71病毒活性的陽性抗體蛋白；

4)克隆已篩選的陽性抗體的可變區輕鏈基因片段V_L與重鏈基因片段V_H，克隆人類抗體IgG輕鏈恒定區基因片段HC_L與重鏈基因片段HC_H，利用重疊PCR將陽性抗體的V_L與HC_L拼接并插入到pcDNA3.1/zeo(+)表達載體中，得到重組質粒pcDNA3.1/zeo-L；將V_H與HC_H拼接并插入到pcDNA3.1(+)表達載體中，得到重組質粒pcDNA3.1-H；分別轉化TOP10 感受態細菌，篩選陽性菌并擴大培養，提取重組質粒，鑒定陽性克隆；利用用于表達完整單克隆抗體A-M的重組質粒pcDNA3.1/zeo-L與pcDNA3.1-H共轉染哺乳動物細胞，純化得到單克隆抗體A-M；

5)將步驟4)中純化后的抗體進行體外中和試驗，檢測抗體中和EV71-C4型病毒的能力，計算獲得步驟4)中獲得的鼠源單克隆抗體A-M的中和效價，篩選得到能夠中和EV71-C4型病毒的鼠源單克隆抗體A-M001。

4.一種重組質粒，包括有SEQ ID NO：1與SEQ ID NO：2的基因序列。

5.一種表達載體，所述載體包含如權利要求1任一項所述單克隆抗體的序列，所述載體為pcDNA3.1/zeo-L與pcDNA3.1-H。

6.一種宿主細胞，轉染權利要求5所述的載體，所述的宿主細胞為CHO細胞或293細胞。

7.一種藥物，所述藥物含有如權利要求1任一項所述單克隆抗體。