[發明專利]一種天女木蘭種子石蠟切片方法

有效

• 申請號: 201510022858.2
• 申請日: 2015-01-19
• 公開（公告）號: CN104614211B
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 陸秀君;梅梅;孫曉梅;張麗杰;王玉濤;馬蓓蓓;張曉林
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司21101
• 代理人: 張述學

技術領域

本發明涉及一種植物種子石蠟切片方法，特別涉及一種天女木蘭種子種胚石蠟切片方法。

背景技術

天女木蘭（Magnolia sieboldii K.Koch.）是木蘭科的落葉小喬木，是稀有的觀賞植物，為國家三級重點保護植物，也是我國東北地區唯一的野生木蘭屬植物。

天女木蘭種子具有生活力較低，休眠期長，萌發率極低，發育不整齊等特性。大大限制了天女木蘭有性生殖的成功率，從而導致林下天然更新苗嚴重缺乏。天女木蘭育苗技術復雜，繁殖難度大，特別是用種子繁殖速度非常慢。因此，開展對天女木蘭種子休眠與萌發的研究既具有學術價值，又具有一定的實際意義。胚是種子萌發的主體，種胚后熟是天女木蘭種子發育不整齊的主要原因，而對天女木蘭種胚萌發的研究少有報道。

石蠟切片是組織學研究的重要實驗技術，基本步驟包括樣品的取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、粘片、脫蠟、染色和封片等一系列特殊處理。實驗步驟并不繁復，但要制出高質量的切片，每一個步驟的操作都很重要，尤其是脫水透明階段，不同植物不同組織對藥品的兼容性有很大差異，需要進行摸索和改進。而天女木蘭種胚石蠟切片技術方面的相關研究報道很少。

綜上所述，如果能找到天女木蘭種胚石蠟切片的制備方法，為研究天女木蘭種子休眠和萌發提供準確的技術支持，對揭示天女木蘭種子休眠機理具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于：針對天女木蘭種子種胚小，胚乳多且胚乳油脂含量高，浸蠟難等原因造成種子切片制作操作難，觀察效果不佳等問題，找到一種操作簡單方便的天女木蘭種子種胚石蠟切片的制備方法，使制作的切片組織結構完整，清晰，易于觀察。

本發明技術方案如下：

1.一種天女木蘭種子石蠟切片方法，其特征在于按如下步驟進行：

（1）取材與固定

種子選取：將去除假種皮的飽滿的天女木蘭種子用濃度0.2%高錳酸鉀溶液消毒30min，用流水沖洗干凈；

樣品固定：將洗凈的種子用吸水紙吸干種子表面水分，剝去種皮，將種子迅速放入盛有FAA固定液的小瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24-72h ；

（2）脫水：固定的材料依次經過65%→75%→85%→95%→100%→100%系列濃度的乙醇溶液逐級脫水，每個濃度梯度脫水時間依次2h→1.5h→1.5h→1h→30min→15min；

（3）透明：經4/5無水乙醇+1/5二甲苯→3/5無水乙醇+2/5二甲苯→2/5無水乙醇+3/5二甲苯→1/5無水乙醇+4/5二甲苯→純二甲苯→純二甲苯，不斷增加二甲苯的體積比例，逐級透明，每級透明時間依次為1.5h→1.5h→1.5h→1.5h→40min→20min；

（4）浸蠟：將材料透明徹底的小瓶倒出1/2或2/3的二甲苯，然后將熔點為52-54℃的石蠟蠟屑放入小瓶中，一直加到二甲苯完全飽和；在40℃下浸蠟24h，之后再用混合石蠟在溫箱中60℃保溫浸蠟，每天換兩次混合蠟液，浸蠟72-120h；混合蠟液是由熔點為58-60℃和熔點為50-52℃的石蠟按重量比1:1的比例融合而成；

（5）包埋：材料浸蠟結束后馬上用鑷子輕輕轉移到裝有液態混合石蠟的小紙盒中，調整好材料位置，再將小紙盒放在盛有冰水的盆中迅速冷卻，待蠟液表面凝固后，迅速倒扣紙盒沉入水中，然后讓其自然漂浮于水中，防止產生結晶；

（6）切片：根據材料在蠟塊中的位置和方向，將蠟塊修成小梯形，然后粘到切片機的蠟臺上進行切片，切片厚度6-8μm；

（7）粘片：在潔凈的載玻片上均勻涂薄層質量體積比為2%明膠，將蠟帶小心地放載玻片上，用蘸有水的毛筆移動蠟帶以調整位置，待蠟帶展平后，將載玻片放在30-35℃水浴鍋上2h，使蠟帶光面緊貼載玻片；之后再將載玻片放入38℃烘箱中烘干；

（8）脫蠟：在染色缸中用純二甲苯30℃保溫脫蠟40min，之后倒掉二甲苯，晾干切片；

（9）封片：切片從染色缸中取出，待二甲苯未揮發完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大樹膠，將蓋玻片一側放置在滴有樹膠的組織切片上，慢慢放下蓋玻片并將空氣完全排除；封好的切片放入40℃恒溫箱中干燥過夜，制成永久切片。

2.根據權利要求1所述的天女木蘭種子石蠟切片方法，其特征在于：FAA固定液組成為：濃度38%甲醛、冰醋酸和濃度70%乙醇，三者體積比為1：1：18。