[發明專利]一種天女木蘭種子石蠟切片方法

有效

• 申請號: 201510022858.2
• 申請日: 2015-01-19
• 公開（公告）號: CN104614211B
• 公開（公告）日: 2017-11-03
• 發明（設計）人: 陸秀君;梅梅;孫曉梅;張麗杰;王玉濤;馬蓓蓓;張曉林
• 申請（專利權）人: 沈陽農業大學
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28
• 代理公司: 沈陽科威專利代理有限責任公司21101
• 代理人: 張述學

1.一種天女木蘭種子石蠟切片方法，其特征在于按如下步驟進行：

（1）取材與固定

種子選取：將去除假種皮的飽滿的天女木蘭種子用濃度0.2%高錳酸鉀溶液消毒30min，用流水沖洗干凈；

樣品固定：將洗凈的種子用吸水紙吸干種子表面水分，剝去種皮，將種子迅速放入盛有FAA固定液的小瓶中固定，4℃冰箱放置，固定24-72h ；

（2）脫水：固定的材料依次經過65%→75%→85%→95%→100%→100%系列濃度的乙醇溶液逐級脫水，每個濃度梯度脫水時間依次2h→1.5h→1.5h→1h→30min→15min；

（3）透明：經4/5無水乙醇+1/5二甲苯→3/5無水乙醇+2/5二甲苯→2/5無水乙醇+3/5二甲苯→1/5無水乙醇+4/5二甲苯→純二甲苯→純二甲苯，不斷增加二甲苯的體積比例，逐級透明，每級透明時間依次為1.5h→1.5h→1.5h→1.5h→40min→20min；

（4）浸蠟：將材料透明徹底的小瓶倒出1/2或2/3的二甲苯，然后將熔點為52-54℃的石蠟蠟屑放入小瓶中，一直加到二甲苯完全飽和；在40℃下浸蠟24h，之后再用混合石蠟在溫箱中60℃保溫浸蠟，每天換兩次混合蠟液，浸蠟72-120h；混合蠟液是由熔點為58-60℃和熔點為50-52℃的石蠟按重量比1:1的比例融合而成；

（5）包埋：材料浸蠟結束后馬上用鑷子輕輕轉移到裝有液態混合石蠟的小紙盒中，調整好材料位置，再將小紙盒放在盛有冰水的盆中迅速冷卻，待蠟液表面凝固后，迅速倒扣紙盒沉入水中，然后讓其自然漂浮于水中，防止產生結晶；

（6）切片：根據材料在蠟塊中的位置和方向，將蠟塊修成小梯形，然后粘到切片機的蠟臺上進行切片，切片厚度6-8μm；

（7）粘片：在潔凈的載玻片上均勻涂薄層質量體積比為2%明膠，將蠟帶小心地放載玻片上，用蘸有水的毛筆移動蠟帶以調整位置，待蠟帶展平后，將載玻片放在30-35℃水浴鍋上2h，使蠟帶光面緊貼載玻片；之后再將載玻片放入38℃烘箱中烘干；

（8）脫蠟：在染色缸中用純二甲苯30℃保溫脫蠟40min，之后倒掉二甲苯，晾干切片；

（9）封片：切片從染色缸中取出，待二甲苯未揮發完全之前，在材料中央滴1滴中性加拿大樹膠，將蓋玻片一側放置在滴有樹膠的組織切片上，慢慢放下蓋玻片并將空氣完全排除；封好的切片放入40℃恒溫箱中干燥過夜，制成永久切片。

2.根據權利要求1所述的天女木蘭種子石蠟切片方法，其特征在于：FAA固定液組成為：濃度38%甲醛、冰醋酸和濃度70%乙醇，三者體積比為1：1：18。