[發(fā)明專利]一種基于菌毛多樣性的尿路感染大腸桿菌的分型方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510022361.0
• 申請日: 2015-01-16
• 公開（公告）號: CN104561326B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 王荃
• 申請（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司12207
• 代理人: 朱紅星

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種對尿路感染大腸桿菌（Uropathogenic?Escherichia?coli,?UPEC）的分型方法，其中包括用于分型的三種菌毛抗原基因（yagV,?fimF,?fimH）的選取及菌毛抗原類型的確定，以及菌毛抗原多樣性在尿路感染大腸桿菌分型中的應(yīng)用。此外，還包括所涉及的菌毛基因特異性擴增的引物序列。

背景技術(shù)

泌尿系統(tǒng)是人類遭受病原細菌感染的最常見部位之一。病原細菌引起的尿路感染（UTI，urinary?tract?infections）會導(dǎo)致急性單純性膀胱炎，急性單純性腎盂腎炎，復(fù)雜性尿路感染，反復(fù)發(fā)作性尿路感染等臨床常見感染性疾病。據(jù)報道，大約40%的女性和12%的男性在一生中至少會經(jīng)歷一次有癥狀的尿路感染，其中10%的女性會在感染后的6-12個月中再次遭受感染。此外，兒童也存在遭受病原細菌引起的尿路感染的風(fēng)險。統(tǒng)計數(shù)據(jù)表明，2006年美國有一千三百萬尿路感染患者。尿路感染也是重要的醫(yī)院感染之一，占美國醫(yī)院感染及菌血癥的首位。病原細菌引起的尿路感染也帶來了巨大的社會經(jīng)濟負擔(dān)，僅以美國的統(tǒng)計數(shù)據(jù)為例，每年花費在其治療方面的費用達到35個億。因此，預(yù)防和控制尿路病原細菌的感染是全球亟待解決的問題。

病原細菌的溯源分析與傳染源的確定是感染性疾病預(yù)防、診斷和控制中切斷感染源的重要科學(xué)依據(jù)。隨著新發(fā)、突發(fā)傳染病對人類威脅的日趨嚴重，人們迫切需要對病原細菌，尤其是新發(fā)病源細菌進行更全面、更高精度的檢測，例如：提供關(guān)于病原細菌致病性、威脅性、流行能力等相關(guān)的更多信息。病原細菌的分子分型及其進化位置為溯源病原細菌提供了關(guān)鍵信息。準確而高分辨率的分型信息為感染性疾病的流行病學(xué)變化以及擴散范圍的檢測與預(yù)警奠定了基礎(chǔ)，同時也為臨床診斷提供了依據(jù)。

病原細菌的分型鑒定中以脈沖場凝膠電泳（Pulsed?field?gel?electrophoresis,?PFGE）和多位點序列分型（Multilocus?sequence?typing，MLST）應(yīng)用最為廣泛，隨著基因組測序技術(shù)的進步，基于全基因組序列的分型分析技術(shù)更為全面的提供了病原細菌的海量信息，對于病原細菌的鑒定非常有效。準確而高分辨率的分型信息為感染性疾病的流行病學(xué)變化以及擴散范圍的檢測與預(yù)警奠定了基礎(chǔ)，同時也為臨床診斷提供了依據(jù)。然而，分辨率不高嚴重影響了PFGE和MLST這兩種方法對臨床菌株的診斷。而全基因組測序就目前來說費用還較高，計算和分析方法還需要進一步的完善，用于日常檢測的可行性還較低。

造成尿路感染的病原細菌主要為革蘭氏陰性細菌，包括大腸桿菌，變形桿菌，普羅維登斯氏菌，銅綠假單胞菌等。其中，大腸桿菌所造成的尿路感染占單純性感染的80%以上，變形桿菌是造成醫(yī)院內(nèi)留置導(dǎo)尿管患者尿路感染的主要元兇。尿路感染細菌在人體中的生存環(huán)境較為特殊，病原細菌實現(xiàn)對宿主細胞的粘附和侵襲需要首先抵抗尿道中尿液的沖洗等，此外造成腎盂腎炎的尿路病原細菌需要順尿道上行至腎，因此尿路病原細菌通常具有豐富的表面抗原，而菌毛抗原是細菌滿足細菌有效粘附和系統(tǒng)性感染的關(guān)鍵作用因子。

菌毛抗原廣泛存在于尿路感染細菌，與宿主尿路上皮細胞的受體特異性結(jié)合，并介導(dǎo)進一步的侵襲。菌毛的結(jié)構(gòu)在種屬水平具有保守型，但菌毛頂端的粘附素具有多態(tài)性，決定了與宿主受體結(jié)合的特異性。此外，菌毛抗原還具有免疫原性和抗原性，成為尿路感染細菌疫苗研發(fā)的靶標。我們前期的分析發(fā)現(xiàn)，根據(jù)尿路感染大腸桿菌I型菌毛抗原基因的多態(tài)性所構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹與根據(jù)這些細菌基因組直系同源基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹非常相似。基于以上特性，我們推測，尿路感染細菌的菌毛多態(tài)性與功能密切相關(guān)，并且具備高分辨率的分型特征，具有作為其分子分型的靶位點的潛力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于公開了一種用于尿路感染大腸桿菌分型的特異性引物，它具有如SEQ?NO:1-50所示。

本發(fā)明進一步公開了采用特異性引物進行尿路感染大腸桿菌分型的方法，其特征在于，該方法通過三種菌毛抗原基因（yagV,?fimF,?fimH）的進化分析以及菌毛抗原類型的鑒定確定尿路感染大腸桿菌的型別，包括樣品預(yù)處理—擴增—電泳檢測結(jié)果—切膠回收電泳樣品—測序—序列比對，構(gòu)建進化樹，其按如下的步驟進行：

（1）基因組的提取