[發(fā)明專利]一種基于菌毛多樣性的尿路感染大腸桿菌的分型方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510022361.0
• 申請(qǐng)日: 2015-01-16
• 公開（公告）號(hào): CN104561326B
• 公開（公告）日: 2017-02-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王荃
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司12207
• 代理人: 朱紅星

1.一種用于尿路感染大腸桿菌分型的特異性引物，其特征在于具有如SEQ?NO:1-50所示。

2.一種采用權(quán)利要求1所述的特異性引物進(jìn)行尿路感染大腸桿菌分型的方法，其特征在于，該方法通過(guò)三種菌毛抗原基因（yagV,?fimF,?fimH）的進(jìn)化分析以及菌毛抗原類型的鑒定確定尿路感染大腸桿菌的型別，包括樣品預(yù)處理—擴(kuò)增—電泳檢測(cè)結(jié)果—切膠回收電泳樣品—測(cè)序—序列比對(duì)，構(gòu)建進(jìn)化樹。

3.權(quán)利要求2所述的尿路感染大腸桿菌分型的方法，其特征在于按如下的步驟進(jìn)行：

（1）基因組的提取

（2）引物的設(shè)計(jì)：針對(duì)尿路感染大腸桿菌編碼22種菌毛ursher蛋白的基因（SEQ?NO:7-50），尿路感染大腸桿菌菌毛抗原基因（yagV,?fimF,?fimH）（SEQ?NO:1-6），設(shè)計(jì)特異性檢測(cè)引物，引物序列如SEQ?NO:1-50所示：

（3）PCR產(chǎn)物的獲得及測(cè)序：

采用步驟（20中所列引物，以尿路感染細(xì)菌的基因組為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，PCR體系為10uM?引物1μl、10×buffer?5μl、10mM?dNTP?0.5μl、5?U/μl?Taq?聚合酶0.5μl及1μl的待測(cè)樣品模板到0.2ml的薄壁PCR管中，最后用ddH₂O補(bǔ)足至50μl，PCR儀上擴(kuò)增；反應(yīng)循環(huán)參數(shù)包括DNA的變性、復(fù)性、延伸的溫度和時(shí)間、循環(huán)次數(shù)，擴(kuò)增產(chǎn)物與10×溴酚藍(lán)上樣緩沖液以9：1的體積比混合；將混合液上樣于2％的瓊脂糖凝膠上；將瓊脂糖凝膠電泳120v穩(wěn)壓電泳約10分鐘，用DL2000?Marker進(jìn)行對(duì)照；目的條帶進(jìn)行切膠，使用康為世紀(jì)大量瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)切膠產(chǎn)物進(jìn)行回收，回收后的產(chǎn)物進(jìn)行Sanger法進(jìn)行DNA雙向測(cè)序；

（4）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì)分析：

對(duì)于GenBank中已公布基因組序列的尿路感染大腸桿菌，將其三種菌毛抗原基因（yagV,?fimF,?fimH）序列和菌毛ursher基因序列下載，將DNA雙向測(cè)序結(jié)果用Staden軟件進(jìn)行序列拼接，校正，每株尿路感染大腸桿菌的三種菌毛抗原基因（yagV,?fimF,?fimH）序列連接，將所測(cè)序的三種基因序列和所下載的三種基因序列用ClustalX進(jìn)行序列比對(duì)，MEG5A，通過(guò)最大似然法進(jìn)行進(jìn)化樹的構(gòu)建，經(jīng)過(guò)1000次驗(yàn)證，根據(jù)進(jìn)化樹的結(jié)果，初步確定尿路感染大腸桿菌的分型；

根據(jù)所下載的ursher基因序列類型及22種菌毛ursher基因在不同菌株中的擴(kuò)增結(jié)果，確定尿路感染大腸桿菌所含有的菌毛類型；

結(jié)合三種菌毛抗原基因（yagV,?fimF,?fimH）所確定的分型結(jié)果和菌株所含有的菌毛類型確定尿路感染大腸桿菌的分型。

4.權(quán)利要求3所述的尿路感染大腸桿菌分型的方法，其中的擴(kuò)增為：前期為使變性能夠達(dá)到所需溫度而必需的前期處理過(guò)程的一個(gè)循環(huán)為94℃，5分鐘；變性溫度和時(shí)間為94℃，50秒；復(fù)性溫度和時(shí)間為50℃，45秒；延伸溫度和時(shí)間為72℃，1秒；變性、復(fù)性、延伸的循環(huán)次數(shù)為30個(gè)循環(huán)；為穩(wěn)定擴(kuò)增產(chǎn)物而進(jìn)行一個(gè)循環(huán)的溫度和時(shí)間為72℃，5分鐘。