[發明專利]檢測Cripto-1的酶聯免疫試劑盒及其制備方法

在審

• 申請號: 201510022203.5
• 申請日: 2015-01-16
• 公開（公告）號: CN104678105A
• 公開（公告）日: 2015-06-03
• 發明（設計）人: 范鈺
• 申請（專利權）人: 鎮江市第一人民醫院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 董建林

技術領域

本發明涉及一種體外診斷試劑制備領域，屬于生物技術領域，具體涉及一種測定血清中畸胎癌衍生生長因子-1（Cripto-1）含量的試劑盒及其制備方法。

背景技術

人類Cripto-1（CR-1）是最早發現的存在于頸椎動物中結構相似的上皮因子（EGF-CFC）家族成員之一。這個家族蛋白的分子結構都有兩個重要的功能位點：一是變異的EGF位點，另一是獨特的富含胱氨酸生物CFC位點。Cripto-1可作為輔助因子參與?TGF-β家族成員的多個細胞信號通路的傳遞過程，還參與活化多條控制細胞增殖與凋亡能力的信號通路。

Cripto-1的生物學作用有很多，包括胚胎發育中原腸胚的形成，哺乳動物乳腺發育和乳蛋白表達，血管發生等。Cripto-1與腫瘤有極高的相關性，在腫瘤細胞的形成、惡變及轉移過程中起作用、是公認的原癌基因，在多種癌細胞和組織中有異常高的表達水平，而在正常的細胞系中則表達量很低或不表達。在廣泛的成人上皮細胞癌中，CR-1被重新表達，預示著干細胞和腫瘤生物學之間的某種聯系。免疫組化的研究表明，在包括乳腺癌，直腸癌，胃癌，胰腺癌，肺癌，卵巢癌，宮頸癌，和輸精管癌等不同的原發癌腫，有50%到80%的病例存在CR-1的升高。

臨床檢測人外周血Cripto-1濃度能給臨床醫生提供預防和治療乳腺癌和結直腸癌的新靶點，為臨床疾病的早期干預、臨床應用治療提供新思路新方向。目前還沒有用于檢測Cripto-1的試劑和方法。

發明內容

為解決現有技術的不足，本發明的目的在于，提供一種檢測Cripto-1的酶聯免疫試劑盒及其制備方法，為血清中Cripto-1檢測提供了快速高效的檢測手段。由于Cripto-1蛋白序列容易在體內變異，在表達單克隆抗體時會產生多種單克隆抗體，所以為了提高試劑盒檢測效率，酶聯免疫試劑盒包被抗體采用兔抗Cripto-1的多克隆抗體，這樣能起到提高檢測效率和降低費用的作用。檢測靈敏度為0.04ng/mL、檢測范圍為0.4～10ng/mL。

本發明的技術方案為：檢測Cripto-1的酶聯免疫試劑盒，其特征是，包括試劑盒盒體，所述盒內放置包被反應板以及分別包裝好的試劑，所述試劑包括標準品、質控品、酶標抗體、濃縮清洗液、顯色劑A、顯色劑B、終止液，所述酶標抗體為用辣根過氧化物酶交聯的鼠抗Cripto-1的單克隆抗體，所述包被反應板用于包被的抗體為兔抗Cripto-1的多克隆抗體。

進一步地，所述顯色劑A為1%四甲基聯苯胺,所述顯色劑B為過氧化氫。

進一步地，所述標準品和質控品分別為Cripto-1的凍干粉，純度為≥95%。

進一步地，所述終止液為硫酸。

進一步地，所述濃縮清洗液為磷酸鹽緩沖液。

本發明還提供了一種檢測Cripto-1的酶聯免疫試劑盒的制備方法，其特征是，包括以下步驟：

（1）包被反應板的制備：

將20-30ug/ml濃度梯度的兔抗Cripto-1的多克隆抗體加入酶標板中，每孔50μl，25°C?2小時后再置4°C過夜,?之后凍干機凍干保持反應板孔中干燥制成包被反應板，4?℃?存放備用；

（2）酶標抗體的制備：

取60ul溶于二甲基甲酞氨的長臂生物素,?加人lml單抗Cripto-1,?25°C反應2小時,?經透析后-20°C凍存；

（3）濃縮清洗液的制備：配制0.1M的磷酸鹽緩沖液；

（4）顯色劑的配制；

（5）終止液的配制：配制2M的H₂SO₄；

進一步地，上述步驟（2）中，所述長臂生物素的濃度為0.01?mol/l，所述單抗Cripto-1的濃度為1mg/ml。

進一步地，上述步驟（3）中，所述磷酸鹽緩沖液包括Na₂HPO₄·12H₂O、KH₂PO₄、NaCl、KCl。

進一步地，上述步驟（4）中，顯色劑A的配制方法為：將檸檬酸溶解在499ml的超純水中，加入TMB，充分溶解后，用稀HCl調pH至2.6，加入超純水，定容到所需體積；顯色劑B的配制方法為：將檸檬酸、十二水合碳酸氫鈉溶解在499ml的超純水中，充分溶解后，用稀HCl調pH至5.2，加入超純水，定容到所需體積。

進一步地，使用前將顯色劑A?液與顯色劑B?液以1∶1體積比混合。