[發明專利]快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA 的方法

在審

• 申請號: 201510019638.4
• 申請日: 2015-01-14
• 公開（公告）號: CN104560957A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 董曉;宋亞峰;黨書毅;周明;王俊峰;段班燕;熊勝梅
• 申請（專利權）人: 董曉;十堰市太和醫院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/53
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

技術領域

本發明涉及分子克隆技術，具體地，涉及一種快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的方法。

背景技術

反轉錄PCR(RT-PCR)是一種從RNA擴增cDNA拷貝的方法。在RT-PCR中首要的步驟為酶促催化使RNA反轉錄為cDNA第一鏈，一條寡聚核苷酸引物先與mRNA雜交，然后由RNA聚合酶催化合成相應互補的cDNA拷貝，后者能進一步用于PCR擴增。目前所用的引物中可以分為特殊靶基因序列設計的引物、隨機引物和oligo(dT)引物。

Oligo(dT)引物能與哺乳動物mRNA的內源poly(A)+尾相結合，作為一種通用引物能用于常規的第一鏈cDNA的合成，這種引物合成出的第一鏈cDNA具有cDNA完整的3‘末端poly(A)+尾，但是由于逆轉錄酶的擴增效率有限，擴增出的cDNA片段多半并非全長cDNA序列，特別是對于較長的cDNA片段很可能不能擴增至完整的5‘末端，這時如果在后續步驟中利用cDNA完整的5’末端引物進行PCR擴增就很可能擴增失敗。隨機六核苷酸引物是能夠沿著RNA模板的許多位點引導cDNA合成，并產生RNA分子總體中的許多片段的拷貝。尤其在靶RNA序列很長或包含很多二級結構使之用oligo(dT)或合成的寡核苷酸引物不能有效引導cDNA合成時，應用隨機六核苷酸引物是非常有用的，這種引物對mRNA的種群無限制，所有種群都能作為PCR模板，而且在擴增時具有非常大的隨機性，可能擴增出較長的帶有完整5‘末端的cDNA片段。

大多數常用質粒都含有可被不同內切酶識別的多克隆位點。由于可供選擇的克隆位點很多，因此一般來說總是能夠找到一個帶有與某一特定外源DNA片段末端相匹配的酶切位點的質粒載體。在無法找到在質粒載體與目的DNA之間符合定向克隆的酶切位點時也可通過設計帶有酶切位點的引物的方法在目的DNA兩段引入特定的酶切位點然后進行定向克隆。(分子克隆實驗指南，J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，科學出版社，2002年8月第三版，68-69)

不同的引物有各自的特性，擴增出的cDNA片段多半不能同時包含全長cDNA的3‘末端和5‘末端。如果需要擴增出完整的cDNA片段，單用一種引物逆轉錄出的cDNA模板，很可能導致擴增失敗。DNA聚合酶的擴增效率有限，而且擴增片段越長，錯配的可能越大。直接擴增出全長的cDNA片段費時費力。

大鼠5-脂肪氧合酶(5-LO)的mRNA編碼區含2,025個堿基，目前人和小鼠的5-LO基因序列已完全清楚，但大鼠的5-LO序列并不完全明確，為了獲取大鼠5-LOcDNA序列，發明人查閱了NCBI和Ensembl網站上所提供的大鼠5-LO?cDNA序列，發現兩者并不完全相同，它們編碼的蛋白有12個氨基酸不相同，其中包括NCBI的序列(NM_012822.1)編碼蛋白所缺失的4個氨基酸。5-LO?mRNA主要存在于各種白細胞中，在其他組織的表達量普遍偏低。5-LO?cDNA編碼區長達2kb以上，無論用何種逆轉錄引物和逆轉錄酶都很難逆轉錄出全長的5-LO編碼區cDNA，而且逆轉錄獲取的cDNA?5’端區常常是不完整的。

為了獲得大鼠5-LO編碼區cDNA以便將來用于5-LO的表達，需要克隆出正確的大鼠5-LO編碼區cDNA。

發明內容

本發明的第一個目的在于提供一種克隆長片段cDNA的方法。

本發明的第二個目的在于提供快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA(5-LO?cDNA)的方法。

發明人發現對于較長片段的cDNA，直接獲取全長cDNA存在困難的情況下可以在cDNA片段中間部位選擇一個酶切位點作為分段克隆的位點，分別設計引物分段從cDNA模板中擴增出兩個片段，然后利用質粒載體通過定向克隆的方法將兩個片段連接從而得到完整的全長cDNA片段。

本發明首先提供一種克隆長片段cDNA的方法，包括以下步驟：

(1)提取mRNA，分別用oligo(dT)和隨機引物逆轉錄mRNA，將兩種cDNA產物混合；

(2)在目的cDNA片段中間位置上選擇酶切位點作為分段擴增的位點，在此位點前后選取序列設計2對引物；

(3)分別用步驟(2)中的兩種引物對步驟(1)獲得的混合cDNA進行分段擴增，選擇不含步驟(2)中用于分段擴增酶切位點的T載體，用T-A連接的方法將兩個片段分別克隆入T載體，再使用特定的限制性內切酶酶切兩種載體，通過定向克隆的方法將兩個片段連接。

本發明還提供了一種快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的方法，包括以下步驟：