[發明專利]快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA 的方法

在審

• 申請號: 201510019638.4
• 申請日: 2015-01-14
• 公開（公告）號: CN104560957A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 董曉;宋亞峰;黨書毅;周明;王俊峰;段班燕;熊勝梅
• 申請（專利權）人: 董曉;十堰市太和醫院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/53
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君

1.一種克隆長片段cDNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取mRNA，分別用oligo(dT)和隨機引物逆轉錄mRNA，將兩種cDNA產物混合；

(2)在目的cDNA片段中間位置上選擇酶切位點作為分段擴增的位點，在此位點前后選取序列設計兩對引物；

(3)分別用步驟(2)中的兩種引物對步驟(1)獲得的混合cDNA進行分段擴增，選擇不含步驟(2)中用于分段擴增酶切位點的T載體，用T-A連接的方法將兩個片段分別克隆入T載體，再使用特定的限制性內切酶酶切兩種載體，通過定向克隆的方法將兩個片段連接。

2.快速克隆大鼠5-脂肪氧合酶cDNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取大鼠mRNA，分別用oligo(dT)和隨機引物逆轉錄mRNA，將兩種cDNA產物混合；

(2)在目的cDNA片段中間位置上選擇一個酶切位點作為分段擴增的位點，在此位點前后選取序列設計2對引物；

(3)分別用步驟(2)中的兩對引物對步驟(1)獲得的混合cDNA進行分段PCR擴增，選擇不含分段擴增酶切位點的克隆載體，用T-A連接的方法將兩個片段分別克隆入載體，然后使用相應的限制性內切酶酶切；通過定向克隆的方法將兩個片段連接。

3.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中大鼠mRNA來自胎鼠肝臟。

4.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(1)中的oligo(dT)為：oligo(dT)15～17。

5.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)的酶切位點為Pml?I。

6.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(2)的2對引物序列分別如SEQ?ID?NO.1-4所示。

7.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)的PCR擴增方法為：94℃30秒，57℃30秒，72℃2分鐘，共30個循環。

8.如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的克隆載體為pBluescript?II?SK(+)。

9.如權利要求2-8任一所述的方法，其特征在于，步驟(3)所述的定向克隆的方法是將插入方向為EcoRI-XhoI的第一段克隆和第二段克隆質粒，分別用XhoI和PmlI酶切，瓊脂糖凝膠分離；切膠回收含有第一段cDNA克隆的T載體和第二段cDNA克隆的條帶。

10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，用玻璃奶純化含有第一段cDNA克隆的T載體和第二段cDNA克隆的條帶后，在T4DNA連接酶反應下連接過夜，連接產物轉化感受態細胞，提取質粒后經EcoRI和XhoI酶切鑒定和測序，選取正確連接的克隆，即可得到全長的5-LOcDNA。