[發明專利]一種煙草復合抗性種質的高通量篩選方法

有效

• 申請號: 201510018006.6
• 申請日: 2015-01-14
• 公開（公告）號: CN104542268A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發明（設計）人: 董春海;王紅林;李鳳明;王菲菲;鄭芳芳;趙宇航;裴海霞
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: A01H3/04
• 分類號: A01H3/04;A01H3/00;A01H1/04
• 代理公司: 青島致嘉知識產權代理事務所 37236
• 代理人: 王曉曉

技術領域

本發明屬于選育技術領域，具體涉及一種煙草復合抗性種質的高通量篩選方法。

背景技術

煙草性喜溫暖濕潤。我國煙區分布廣泛，南方煙區的早春低溫與北方煙區的夏季干旱對煙葉的產量和品質造成很大影響。乙烯作為重要的植物激素在植物應對生物脅迫和非生物脅迫過程中起到了至關重要的作用，一些乙烯突變體常表現出抗逆性。在水稻中表達乙烯響應因子JERF1/3可以提高轉基因植物的耐旱性。在煙草和番茄中分別過表達乙烯響應因子TERF2/LeERF2提高了轉基因植物的耐寒性。擬南芥的乙烯不敏感突變體如etr1-1，ein4-1，ein3-1提高了耐凍性。但是，利用乙烯“三重反應”篩選具有復合抗性的新種質材料尚無報道。

發明內容

本發明的目的是提供了一種煙草復合抗性種質的高通量篩選方法，具體包括：乙烯不敏感種質的篩選、乙烯不敏感-耐寒種質的篩選以及乙烯不敏感-耐寒-耐旱復合抗性種質的篩選。

為實現上述發明目的，本發明采用以下技術方案予以實現：

一種煙草復合抗性種質的高通量篩選方法，它包括以下步驟：

（1）煙草乙烯不敏感種質的篩選

a、表面消毒：取待篩選的煙草種子與煙草野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無菌水沖洗；

b、低溫處理：將已消毒的所述煙草種子點播在1/2?MS+100?μM?ACC的培養基上，并將其置于4℃，黑暗培養3?d；

c、光照催芽與暗培養：于25℃光照培養10?h；之后將其于25℃下避光暗培養5-6?d；

d、乙烯不敏感種質的鑒別：煙草野生型種子出現“三重反應”的表型：幼苗的主根變短、下胚軸縮短變粗、子葉形成頂鉤；“三重反應”呈現不明顯表型的為乙烯不敏感種質；

（2）乙烯不敏感-耐寒復合種質的篩選

以所述篩選出的乙烯不敏感種質的煙草種子為測試材料，以煙草野生型種子為對照，按以下步驟進行篩選：

a、表面消毒：取所述煙草乙烯不敏感種質與野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無菌水沖洗；

b、低溫處理：將已消毒的煙草種子點播在1/2?MS的培養基平板上，并將其置于4℃，黑暗培養3?d；

c、處理前光照培養：于25℃光照條件下培養3?d至種子萌發；

d、低溫篩選：選取萌發一致的幼苗轉移到1/2?MS的培養基平板上，然后用錫箔紙包起來在4℃低溫下暗培養60?d；

e、乙烯不敏感-耐寒種質的鑒別：煙草野生型在低溫條件下根長及下胚軸生長受抑制變短，而“乙烯不敏感-耐寒”抗性種質的根長及下胚軸生長不受抑制或抑制較輕，篩選出乙烯不敏感-耐寒抗性種質。

與現有技術相比，本發明的優點和技術效果是：本發明建立了煙草“乙烯不敏感-耐寒”與“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”復合抗性種質的高通量篩選方法。篩選煙草乙烯不敏感種質資源主要依據黑暗條件下萌發的幼苗呈現特有的“三重反應”：在無光照的培養條件下，外源乙烯處理會使萌發的幼苗的主根生長受到抑制，下胚軸縮短變粗，子葉形成特別的頂鉤。基于這個特點，可快速篩選出乙烯不敏感種質。在含有乙烯前體物ACC（1-aminocyclopropane-1-carboxylic?acid）的培養基上無光照培養，野生型幼苗表現出典型的“三重反應”，而乙烯不敏感種質的“三重反應”則表現不明顯。對于乙烯不敏感-耐寒種質的篩選，本發明本著采用高通量、簡易、快捷的原則，采用了最簡單的條件以及簡明的評價判別方法，進行了獨創性改進。本發明所述煙草復合抗性種質的篩選方法對抗逆育種以及研究乙烯對抗逆的影響提供了簡易的基礎材料篩選途徑。

附圖說明

圖1枚舉本發明利用“三重反應”于100?μM?ACC培養基上篩選煙草乙烯不敏感種質。

圖2枚舉本發明利用煙草乙烯不敏感種質于4℃處理60?d進一步篩選耐寒種質。

圖3枚舉本發明利用煙草乙烯不敏感-耐寒種質繼續進行耐旱篩選，即在200?mM甘露醇濃度下野生型與抗性種質的生長情況。

具體實施方式

為使本發明實施目的、技術方案和優點更加清楚，如下結合本發明實施個例中的附圖，對本發明實施中的技術方案進行清楚、完整地描述。

實施例1

本發明煙草復合抗性種質的篩選方法的具體步驟如下：

1、煙草乙烯不敏感種質的高通量初步篩選