[發(fā)明專利]一種煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510018006.6
• 申請(qǐng)日: 2015-01-14
• 公開（公告）號(hào): CN104542268A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 董春海;王紅林;李鳳明;王菲菲;鄭芳芳;趙宇航;裴海霞
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H3/04
• 分類號(hào): A01H3/04;A01H3/00;A01H1/04
• 代理公司: 青島致嘉知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 37236
• 代理人: 王曉曉

1.一種煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，其特征在于它包括以下步驟：

（1）煙草乙烯不敏感種質(zhì)的篩選

a、表面消毒：取待篩選的煙草種子與煙草野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無(wú)菌水沖洗；

b、低溫處理：將已消毒的所述煙草種子點(diǎn)播在1/2?MS+100?μM?ACC的培養(yǎng)基上，并將其置于4℃，黑暗培養(yǎng)3?d；

c、光照催芽與暗培養(yǎng)：于25℃光照培養(yǎng)10?h；之后將其于25℃下避光暗培養(yǎng)5-6?d；

d、乙烯不敏感種質(zhì)的鑒別：煙草野生型種子出現(xiàn)“三重反應(yīng)”的表型：幼苗的主根變短、下胚軸縮短變粗、子葉形成頂鉤；“三重反應(yīng)”呈現(xiàn)不明顯表型的為乙烯不敏感種質(zhì)；

（2）乙烯不敏感-耐寒復(fù)合種質(zhì)的篩選

以所述篩選出的乙烯不敏感種質(zhì)的煙草種子為測(cè)試材料，以煙草野生型種子為對(duì)照，按以下步驟進(jìn)行篩選：

a、表面消毒：取所述煙草乙烯不敏感種質(zhì)與野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無(wú)菌水沖洗；

b、低溫處理：將已消毒的煙草種子點(diǎn)播在1/2?MS的培養(yǎng)基平板上，并將其置于4℃，黑暗培養(yǎng)3?d；

c、處理前光照培養(yǎng)：于25℃光照條件下培養(yǎng)3?d至種子萌發(fā)；

d、低溫篩選：選取萌發(fā)一致的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2?MS的培養(yǎng)基平板上，然后用錫箔紙包起來(lái)在4℃低溫下暗培養(yǎng)60?d；

e、乙烯不敏感-耐寒種質(zhì)的鑒別：煙草野生型在低溫條件下根長(zhǎng)及下胚軸生長(zhǎng)受抑制變短，而“乙烯不敏感-耐寒”抗性種質(zhì)的根長(zhǎng)及下胚軸生長(zhǎng)不受抑制或抑制較輕，篩選出乙烯不敏感-耐寒抗性種質(zhì)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，其特征在于：在篩選出的乙烯不敏感-耐寒種質(zhì)的基礎(chǔ)上再進(jìn)行耐旱抗性種質(zhì)的篩選，步驟如下：

a、表面消毒：取上述篩選出的乙烯不敏感-耐寒抗性種質(zhì)與野生型種子用次氯酸鈉消毒后用無(wú)菌水沖洗；

b、低溫處理：將已消毒的煙草種子點(diǎn)播在1/2?MS的培養(yǎng)基平板上，并將其置于4℃，黑暗培養(yǎng)3?d；

c、處理前光照培養(yǎng)：于25℃光照條件下培養(yǎng)7-10?d至真葉剛剛出現(xiàn)；

d、模擬干旱處理：選取出芽一致的幼苗轉(zhuǎn)移到1/2?MS+200?mM甘露醇培養(yǎng)基平板上，于25℃光照培養(yǎng)30?d；

e、乙烯不敏感-耐寒-耐旱復(fù)合抗性種質(zhì)的鑒別：煙草野生型在模擬干旱的條件下出現(xiàn)植株變黃、矮小癥狀，生長(zhǎng)不受抑制或抑制較輕的為“乙烯不敏感-耐寒-耐旱”復(fù)合抗性種質(zhì)。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，其特征在于：所述1/2?MS+100?μM?ACC的培養(yǎng)基的配制方法為：不加蔗糖的PH為5.8的1/2?MS培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后冷卻至50-60℃，加入過(guò)濾除菌的ACC使其終濃度達(dá)到100?μM。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的煙草復(fù)合抗性種質(zhì)的高通量篩選方法，其特征在于：所述1/2?MS+200?mM甘露醇培養(yǎng)基的配制方法為：向1/2?MS培養(yǎng)基加入甘露醇終濃度達(dá)到200?μM，使其PH為5.8，經(jīng)高壓滅菌后冷卻。