[發明專利]小麥黑穗菌(Tilletia controversa Kühn)的實時熒光定量鑒定方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201510017724.1
• 申請日: 2015-01-14
• 公開（公告）號: CN104774919A
• 公開（公告）日: 2015-07-15
• 發明（設計）人: 高利;陳萬權;蔚慧欣;劉太國;劉博
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院植物保護研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 吳泳歷

技術領域

本發明涉及植物病害檢測技術，特別是一種小麥黑穗菌(Tilletia?controversa?Kühn)的實時熒光定量鑒定方法。

背景技術

小麥矮腥黑穗病菌(Tilletia?controversa?Kühn，簡稱TCK)引起的小麥矮腥黑穗病是一種重要的國際檢疫性病害，對小麥生產造成嚴重的危害，也是我國外來生物入侵研究的主要物種之一(王圓，1997)。在其流行年份，小麥矮腥黑穗病引起的產量損失一般為20％～50％，嚴重時可達75％～90％，甚至絕產。病菌抗逆性極強，其冬孢子在土中可存活3～7年，包裹在菌癭中的冬孢子甚至可保持活力長達10年以上。此病害一旦發生，很難防治或根除，所以國際上有15個國家將其列為檢疫對象。我國在20世紀60年代把此病害列為檢疫對象。在腥黑粉菌中，TCK與其近緣種小麥網腥黑粉菌、小麥光腥黑粉菌等在形態學上極為相似，難于區別。

傳統的病害診斷、檢測方法主要是依據病原形態學、生理學和生物化學的特性，不但過程繁瑣、時間周期長，而且準確性差、精度不高。因此，利用分子生物學手段快速、準確地鑒別小麥矮腥黑粉菌具有重要的意義。

1996年Ferreira等首次將PCR技術引進到印度腥黑穗病的鑒定中來，他們選擇了印腥線粒體DNA的一個2.3kb的EcoR1片段進行了克隆和測序，設計的特異性引物TI1/TI4從25種腥黑穗病菌菌株中鑒定出了印腥。另外，Smith等通過克隆印腥線粒體DNA的Dra1片段，進行了序列分析，設計了兩套寡核苷酸引物對Ti17/M1和Ti17/M2能分別從印腥中擴增出大小為825bp和118bp特異性片段，也實現了對印度腥黑穗病的檢測鑒定工作。2000年Frederick根據線粒體的差異設計了5對針對印度腥黑穗病的特異性引物和3對針對黑麥草腥黑穗病的特異性引物，分別能將印度腥黑穗病菌株和黑麥草腥黑穗病菌株從其近緣屬種中鑒別出來。張競宇等利用核糖體ITS序列上的差異在Tilletia屬20個種中設計了一對特異性引物T1/T2，能將T.indica和T.walkeri從其它種中區分開來，而后又根據T.indica和T.walkeri線粒體之間的差異設計了一對特異性引物M1/M2,可以將二者區分開來，為了使反應更為靈敏，建立了套式PCR技術，以便于提供更簡單的鑒定方法。2004年高強利用RAPD技術找到了一條可以將小麥網腥黑穗病菌株和小麥矮腥黑穗病菌株區別于其它黑粉菌株的條帶，但是很遺憾在矮腥黑粉菌和網腥黑粉菌之間沒有找到有差異的條帶，沒能將二者分開。梁宏等人依據核糖體的IGS1區特性，設計了一對特異性引物，可以將小麥光腥黑穗病菌株從其近緣屬種中鑒別出來。

發明人前期研究中獲得TCK差異片段661bp(Seq?ID?No.1)，并根據所得差異片段獲得?TCK?Scar標記及引物，見專利號201110051404.X記載。該標記能用于常規PC鑒定TCK菌，能夠特異性地將TCK從近似菌種中鑒定出來。但是發明人發現，該專利中的標記引物及PCR方法不能很好地應用于預警小麥矮腥黑穗病以及篩選抗TCK小麥品種方面，可能是因為感染TCK且未表現病征的病株中，提取DNA后，TCK的DNA所占比例太小，也就是濃度太低，而普通PCR的靈敏性不足于檢測到如此低濃度的模板。眾所周知，實時定量PCR在靈敏度方面顯著優越于普通PCR，因此發明人嘗試將該Scar標記引物用于實時定量PCR來擴增TCK樣本,但是無論是在實時熒光定量方法中還是在TaqMan水解探針法定量PCR中，都擴增不出信號。

為了能順利利用實時定量PCR方法鑒定小麥矮星黑穗病，有必要通過設計篩選適合于實時定量PCR方法的特異性PCR引物，優化PCR反應體系得出一套靈敏性高、特異性好的實時定量檢測方法。

發明內容

本發明根據上述領域的現狀及需求，根據前期研究中篩選到的TCK差異基因片段Seq?ID?No.1，設計出TCK特異性引物及探針，基于ABI7500熒光定量擴增儀,優化Real-Time?PCR反應體系，成功地建立SYBRGreenⅠ熒光染料法定量PCR檢測體系檢測TCK。

本發明建立的實時定量SYBRGreenⅠ熒光染料法檢測TCK的技術方案如下：

小麥黑穗菌(Tilletia?controversa?Kühn)的實時熒光定量鑒定方法，包括如下步驟：

(1)獲得TCK陽性質粒標準品的實時定量標準曲線，其中Ct值為縱坐標，起始模板拷貝數為橫坐標；

(2)提取待測樣品的DNA；