[發(fā)明專利]一種樹突狀細胞的制備方法、所得樹突狀細胞

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510015556.2
• 申請日: 2015-01-13
• 公開（公告）號: CN104531617A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 史軍;呂垚
• 申請（專利權(quán)）人: 北京益諾勤生物技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N5/0784
• 分類號: C12N5/0784
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細胞免疫技術(shù)領(lǐng)域，特別一種樹突狀細胞的制備方法、所得樹突狀細胞。

背景技術(shù)

細胞免疫治療療法是采集人體自身免疫細胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，使其數(shù)量成千倍增多、靶向殺傷功能增強，然后再回輸?shù)饺梭w來殺滅血液及組織中的病原體、癌細胞、突變的細胞，打破免疫耐受、激活和增強機體的免疫能力，兼顧治療和保健的雙重功效。細胞免疫治療具有副作用小、靶向治療、作用范圍更加廣泛等特點，在臨床研究中備受關(guān)注。據(jù)報道，經(jīng)過多個療程的細胞免疫治療，能夠有效殺除患者體內(nèi)腫瘤細胞，促進康復(fù)，改善患者的生活質(zhì)量。樹突狀細胞療法是目前研究最多的細胞免疫治療療法之一。

樹突狀細胞(Dendritic?cells，DC)是體內(nèi)功能最強的抗原遞呈細胞(Antigen?presenting?cell，APC)，一方面，其能夠刺激初始的T細胞增殖，啟動免疫應(yīng)答；另一方面，樹突狀細胞還能夠呈遞抗原給MHC-I類限制性CD8⁺和MHC-II類限制性CD4⁺T淋巴細胞，誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，被稱為“天然免疫佐劑”，因此，樹突狀細胞在誘導(dǎo)免疫應(yīng)答中具有獨特的地位。近年來，以DC細胞為基礎(chǔ)的免疫治療在臨床應(yīng)用中得到越來越廣泛的關(guān)注，是國內(nèi)外研究的熱點。

隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)充足的DC細胞成為了DC細胞免疫治療研究中的技術(shù)瓶頸。現(xiàn)有的DC細胞制備方法中，大多采用抽取外周血培養(yǎng)，分離出造血干細胞，之后在多種細胞因子存在下培養(yǎng)、誘導(dǎo)所得造血干細胞，制備獲得DC細胞。整個過程操作復(fù)雜，并且因為細胞來源數(shù)量低、所得造血干細胞的數(shù)量也少，最終影響了DC細胞數(shù)量和質(zhì)量，導(dǎo)致治療效果不理想。所以，十分有必要需找新的DC細胞的制備方法。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明的發(fā)明目的在于提供了一種樹突狀細胞的制備方法、所得樹突狀細胞。本發(fā)明利用間充質(zhì)干細胞，成功制備獲得了樹突狀細胞，為樹突狀細胞的制備提供了一種新的制備方法，且操作簡單，可用于樹突狀細胞的大量制備。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供了一種樹突狀細胞的制備方法，其包括以下步驟：

步驟1：獲得間充質(zhì)干細胞；

步驟2：取所得間充質(zhì)干細胞，貼壁培養(yǎng)后，得貼壁細胞；

步驟3：培養(yǎng)、誘導(dǎo)所得貼壁細胞，收集樹突狀細胞。

間充質(zhì)干細胞(mesenchymal?stem?cells,MSC)，是一類多能干細胞，源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。主要存在于結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富，由于骨髓是其主要來源，因此統(tǒng)稱為骨髓間充質(zhì)干細胞。間充質(zhì)干細胞屬于非終末分化細胞，它既有間質(zhì)細胞，又有內(nèi)皮細胞及上皮細胞的特征。間充質(zhì)干細胞在體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、軟骨、骨、肌肉、肌腱、神經(jīng)、肝、心肌、胰島β細胞和內(nèi)皮等多種組織細胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能。不論是自體還是同種異源的間充質(zhì)干細胞，一般都不會引起宿主的免疫反應(yīng)。由于間充質(zhì)干細胞具備的這種免疫學特性，使其在自身免疫性疾病以及各種替代治療等方面具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。通過自體移植可以重建組織器官的結(jié)構(gòu)和功能，并且可避免免疫排斥反應(yīng)。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中的間充質(zhì)干細胞為臍帶間充質(zhì)干細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞或脂肪間充質(zhì)干細胞。在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中的間充質(zhì)干細胞為臍帶間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明以間充質(zhì)干細胞為種子細胞，貼壁培養(yǎng)后，誘導(dǎo)所得貼壁細胞，即制備獲得樹突狀細胞，操作簡單，可用于樹突狀細胞的大量制備。

優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，步驟3中的誘導(dǎo)所用誘導(dǎo)試劑包括第一誘導(dǎo)試劑和第二誘導(dǎo)試劑；

該第一誘導(dǎo)試劑包括GM-CSF、IL-4、胎牛血清和谷氨酰胺；

該第二誘導(dǎo)試劑包括TNF-α。

GM-CSF為粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子，是一種細胞因子。優(yōu)選地，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中GM-CSF的濃度100ng/mL～200ng/mL。在本發(fā)明的一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中的GM-CSF的濃度為100ng/mL。在本發(fā)明的另外一些實施例中，本發(fā)明提供的制備方法中，第一誘導(dǎo)試劑中的GM-CSF為rhGM-CSF。