[發(fā)明專利]一種蘇云金芽孢桿菌及選育方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510015310.5
• 申請日: 2015-01-13
• 公開（公告）號: CN104845897A
• 公開（公告）日: 2015-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉士平;秦王閣閣;田偉;曾文;孔玉珊;蔣維;薛艷紅
• 申請（專利權(quán)）人: 三峽大學(xué)
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;A01N63/00;A01P1/00;C12R1/07
• 代理公司: 宜昌市三峽專利事務(wù)所 42103
• 代理人: 蔣悅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種蘇云金芽孢桿菌及選育方法，及其在制備生物農(nóng)藥領(lǐng)域中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

軟腐病俗稱“半邊瘋”，是魔芋生產(chǎn)上危害最嚴(yán)重的病害。魔芋軟腐病屬軟腐歐文氏菌屬(Erwinia)，是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，胡蘿卜軟腐歐氏桿菌胡蘿卜軟腐亞種(Erwinia?carotovora?subsp.carotovora)，栽培期及貯藏期可發(fā)病，影響產(chǎn)量和品質(zhì)。魔芋種植業(yè)每年因軟腐病損失巨大。

幾個世紀(jì)以來，化學(xué)農(nóng)藥在植物病蟲害的防治中發(fā)揮了巨大作用，為農(nóng)業(yè)的增產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)和提高品質(zhì)做出了重要貢獻(xiàn)。但是由于過量施用和濫用農(nóng)藥導(dǎo)致地力衰退和環(huán)境污染。尤其近幾年來由于農(nóng)藥殘留超標(biāo)，嚴(yán)重影響了人們的生活質(zhì)量。在當(dāng)前農(nóng)作物無公害栽培中，微生物農(nóng)藥越來越受到重視。因為它們不僅防治病蟲害的效果好，而且對環(huán)境友好、對農(nóng)作物無污染，病蟲對其不易產(chǎn)生抗藥性。因此，在生物農(nóng)藥中，以微生物農(nóng)藥用途多、應(yīng)用前景最為廣闊。

芽孢桿菌屬的細(xì)菌為好氧或兼性厭氧的桿菌，廣泛分布在水、空氣和土壤中。芽孢桿菌在孢子狀態(tài)下穩(wěn)定性好，能耐氧化；耐擠壓；耐高溫，能長期耐60℃高溫，在120℃溫度下能存活20分鐘；耐酸堿，在酸性胃環(huán)境中能保持活性，可以耐唾液和膽汁的攻擊，是飼料微生物中可100％直達(dá)大小腸的活菌。同時本品具有安全高效，無藥殘，無毒副作用，能減少抗生素藥物的使用，增強(qiáng)免疫力的優(yōu)點(diǎn)，因而在生物防止病蟲害中起著重要作用。目前芽孢桿菌屬用于防止病蟲害主要有：枯草芽孢桿菌、臘狀芽孢桿菌、短小芽孢桿菌等。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種蘇云金芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ML1，該蘇云金芽孢桿菌對魔芋軟腐病原有很好的抑制作用，為開發(fā)新的生物農(nóng)藥品種、植物生物防治菌劑提供了新選擇。

所述蘇云金芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ML1是從疏花水柏枝(MyricariaLaxiflora)的葉中獲得的內(nèi)生細(xì)菌，于2014年5月5日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為，CCTCC?NO：M2014181。保藏地址為中國，武漢，武漢大學(xué)。

本發(fā)明蘇云金芽孢桿菌(Bacillussubtilis)ML1在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上具有以下微生物學(xué)特性：米白色，表面較干燥，單菌落較小且呈圓形，革蘭氏陽性，具有芽孢。

本發(fā)明還提供蘇云金芽孢桿菌的選育方法，包括如下步驟：

1)取疏花水柏枝葉，加入無菌水中，研磨搗碎得組織液，吸取組織液加入無菌水中，再用無菌水稀釋組織液濃度至10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6、10^-7共7個濃度梯度；

2)取上述各濃度梯度稀釋液100μL分別涂布于培養(yǎng)基平板中，倒置恒溫箱內(nèi)30℃培養(yǎng)；

3)待上述平板上長出菌落后，挑取單菌落于滅菌的培養(yǎng)基中，恒溫30℃振蕩培養(yǎng)24小時，得到細(xì)菌培養(yǎng)液；

4)在滅菌的菌種管中，加入1.0mL細(xì)菌培養(yǎng)液，0.5ml?50％的甘油，混勻后于-86℃冰箱保存；5)取-86℃冰箱保存的蘇云金芽孢桿菌菌株菌種劃線接種于斜面培養(yǎng)基中，30℃下，培養(yǎng)12小時；

6)將上述菌體劃線接種于培養(yǎng)基中，30℃下，培養(yǎng)18小時，獲得蘇云金芽孢桿菌體。

所述的培養(yǎng)基是將牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、無菌水以質(zhì)量比為2：2：1：4：11混合后，在121℃滅菌20min后制得。

將上述蘇云金芽孢桿菌，或以蘇云金芽孢桿菌為活性成分制得的菌劑應(yīng)用于制備生物防治植物病害的菌劑。

或，將上述蘇云金芽孢桿菌菌株，或以蘇云金芽孢桿菌菌株為活性成分所制得的菌劑應(yīng)用于制備生物防治植物病害的菌劑。

或，將上述云金芽孢桿菌菌株的微生物菌劑，或以蘇云金芽孢桿菌菌株的微生物菌劑為活性成分制得的菌劑應(yīng)用于制備生物防治植物病害的菌劑。

另，將上述蘇云金芽孢桿菌或以蘇云金芽孢桿菌為活性成分應(yīng)用于制備生物農(nóng)藥或以蘇云金芽孢桿菌為組分或活性成分應(yīng)用于制備生物農(nóng)藥組合物。

或，將上述蘇云金芽孢桿菌菌株的發(fā)酵液或懸乳液，或以蘇云金芽孢桿菌菌株的發(fā)酵液或菌懸液為活性成分應(yīng)用于制備生物農(nóng)藥；或以蘇云金芽孢桿菌菌株的發(fā)酵液或菌懸液為組分或活性成分應(yīng)用于制備生物農(nóng)藥組合物。