[發(fā)明專利]一種山羊的抗衰老基因的合成、轉(zhuǎn)染及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510014918.6
• 申請日: 2015-01-09
• 公開（公告）號: CN104745627A
• 公開（公告）日: 2015-07-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫曉鳳;李蘭;程順峰;沈偉
• 申請（專利權(quán)）人: 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/53;C12N5/10
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種山羊的抗衰老基因的合成、轉(zhuǎn)染及檢測方法。

背景技術(shù)

n-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated?fatty?acids，以下簡稱PUFAs)是細(xì)胞膜的重要組成部分，在人類很多疾病的預(yù)防和控制方面發(fā)揮重要作用。但是對哺乳動物來說，由于其體內(nèi)缺少能夠?qū)-6PUFAs轉(zhuǎn)化為n-3PUFAs的脂肪酸脫氫酶，因此不能內(nèi)源性合成，但是日益成熟的轉(zhuǎn)基因技術(shù)使得生產(chǎn)出自身合成n-3PUFAs的轉(zhuǎn)基因動物成為可能。但是轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身可能會給轉(zhuǎn)基因動物帶來一定的負(fù)面影響，例如，細(xì)胞衰老等。因此，如果要鑒定轉(zhuǎn)入的外源基因?qū)?xì)胞衰老等方面的影響，必須排除轉(zhuǎn)基因技術(shù)本身帶來的影響。

含有兩個或者或兩個以上雙鍵的脂肪酸通常被稱為多不飽和脂肪酸(PUFA)。脂肪酸是脂肪的重要組成成分。長鏈多不飽和脂肪酸通常分為n-3(ω-3)和n-6(ω-6)兩類。這兩類脂肪的代謝和功能不同，且往往具有相反的生理功能，往往是具有相反功能的信號分子的前體分子。眾所周知，n-3多不飽和脂肪酸對人類健康是大有裨益的，它作為細(xì)胞膜的重要組成部分，可以抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。但是n-6多不飽和脂肪酸對細(xì)胞具有相反的作用，n-6多不飽和脂肪酸的過度攝入可以引起炎癥和心血管疾病病。因此，提高n-3多不飽和脂肪酸的攝入量是非常重要的。研究表明：飲

食中n-6和n-3多不飽和脂肪酸的的比值接近3∶1或者4∶1時，對健康有益。但是由于動物性食品的過多攝入及魚油等的過低攝入導(dǎo)致目前飲食中n-6和n-3的比例過高。因為哺乳動物細(xì)胞缺乏自身合成n-3多不飽和脂肪酸和將n-6多不飽和脂肪酸轉(zhuǎn)化為n-3多不飽和脂肪酸的酶，n-3多不飽和脂肪酸必須依靠膳食補(bǔ)充劑。

為了滿足日益增長的人口對n-3多不飽和脂肪酸需求，必須發(fā)展一種可持續(xù)的n-3多不飽和脂肪酸資源。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明提供了一種山羊的抗衰老基因的合成、轉(zhuǎn)染及檢測方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種山羊的抗衰老基因的合成、轉(zhuǎn)染及檢測方法，包括如下步驟：

S1、根據(jù)GenBank中的的線蟲序列(ACCESSION?NM_001028389)，采用化學(xué)合成法合成針對哺乳動物進(jìn)行過密碼子優(yōu)化的FatI基因的編碼區(qū)序列，并在起始密碼子ATG之前加上了一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含了有利于基因表達(dá)的Kozak序列，并在其上下游分別引入了HindIII，KpnI限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的保護(hù)堿基；

S2、將步驟S1合成的序列連接到克隆載體pUC57載體中，獲得重組質(zhì)粒pUC57-FatI，將pUC57-FatI和真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)用限制性內(nèi)切酶HindIII，KpnI進(jìn)行雙酶切，膠回收相應(yīng)的片段，將FatI基因連接入將連接入真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)中獲得重組質(zhì)粒pCDNA3.1(+)-FatI；由于pCDNA3.1(+)-FatI上具有2個SalI酶切位點(diǎn)，將經(jīng)過質(zhì)粒抽提獲得的pCDNA3.1(+)-FatI用SalI酶切后膠回收相對大的片段，以備轉(zhuǎn)染。

S3、取懷孕35天的波爾山羊，手術(shù)迅速取出山羊胎兒，用含雙抗的PBS沖洗2遍，在超凈工作臺上將山羊胎兒去頭去尾去內(nèi)臟，剩下的部分用剪刀剪碎后加胰酶消化30min，用移液器吹打至大部分為單個細(xì)胞，將所得的細(xì)胞置于添加有10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/L硫酸鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基上，5％CO₂培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)；

S4、當(dāng)步驟S3中細(xì)胞匯合度達(dá)到85％左右時，用胰酶消化收集步驟S3所得的細(xì)胞，并用PBS沖洗2次，以徹底去掉胰酶，用無抗生素的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞，加入經(jīng)過酶切回收的帶有FatI基因的DNA，混合后冰浴10min，用電穿孔儀ECM830進(jìn)行電轉(zhuǎn)染；取出電擊杯，冰浴10min后，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中在37℃，5％CO2環(huán)境的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；細(xì)胞培養(yǎng)至24小時后加G418，進(jìn)行抗性篩選；

S5、經(jīng)過11天的培養(yǎng)篩選，培養(yǎng)皿中開始出現(xiàn)陽性克隆，將陽性克隆挑出后培養(yǎng)于96孔板中，然后逐級放大到24孔板和6孔板中，得到穩(wěn)定表達(dá)促使細(xì)胞內(nèi)n-6脂肪酸向n-3脂肪酸轉(zhuǎn)化的FatI基因序列的細(xì)胞株；