[發明專利]一種山羊的抗衰老基因的合成、轉染及檢測方法

在審

• 申請號: 201510014918.6
• 申請日: 2015-01-09
• 公開（公告）號: CN104745627A
• 公開（公告）日: 2015-07-01
• 發明（設計）人: 孫曉鳳;李蘭;程順峰;沈偉
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/53;C12N5/10
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

1.一種山羊的抗衰老基因的合成、轉染及檢測方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、根據GenBank中的的線蟲序列，采用化學合成法合成針對哺乳動物進行過密碼子優化的FatI基因的編碼區序列，并在起始密碼子ATG之前加上了一段序列GTTGCGGCCGCCACC，其中包含了有利于基因表達的Kozak序列，并在其上下游分別引入了HindIII，KpnI限制性內切酶的酶切位點及相應的保護堿基；

S2、將步驟S1合成的序列連接到克隆載體pUC57載體中，獲得重組質粒pUC57-FatI，將pUC57-FatI和真核表達載體pCDNA3.1(+)用限制性內切酶HindIII，KpnI進行雙酶切，膠回收相應的片段，將FatI基因連接入將連接入真核表達載體pCDNA3.1(+)中獲得重組質粒pCDNA3.1(+)-FatI；將經過質粒抽提獲得的pCDNA3.1(+)-FatI用SalI酶切后膠回收相對大的片段，以備轉染；

S3、取懷孕35天的波爾山羊，手術迅速取出山羊胎兒，用含雙抗的PBS沖洗2遍，在超凈工作臺上將山羊胎兒去頭去尾去內臟，剩下的部分用剪刀剪碎后加胰酶消化30min，用移液器吹打至大部分為單個細胞，將所得的細胞置于添加有10％胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/L硫酸鏈霉素的DMEM/F12培養基上，5％CO₂培養箱中37℃培養；

S4、當步驟S3中細胞匯合度達到85％左右時，用胰酶消化收集步驟S3所得的細胞，并用PBS沖洗2次，以徹底去掉胰酶，用無抗生素的細胞培養基稀釋細胞，加入經過酶切回收的帶有FatI基因的DNA，混合后冰浴10min，用電穿孔儀ECM830進行電轉染；取出電擊杯，冰浴10min后，將細胞轉移至培養皿中在37℃，5％CO2環境的培養箱中培養；細胞培養至24小時后加G418，進行抗性篩選；

S5、經過11天的培養篩選，培養皿中開始出現陽性克隆，將陽性克隆挑出后培養于96孔板中，然后逐級放大到24孔板和6孔板中，得到促使細胞內n-6脂肪酸向n-3脂肪酸轉化的穩定表達FatI基因序列的細胞株；

S6、基因組PCR初步檢測陽性細胞：對步驟S5培養過程中留在原培養板上的細胞繼續培養，待細胞鋪滿培養板時用胰酶消化收集細胞，用基因組抽提試劑盒提取細胞的基因組，PCR初步檢測外源基因是否進入細胞；

S7、FatI的mRNA水平表達檢測：基因組PCR檢測為陽性的一個細胞株，利用EASYspinRNA快速抽提試劑盒進行RNA的提取，反轉錄后進行定量PCR檢測細胞株中FatI的mRNA表達水平；

S8、脂肪酸組成分析：轉Fat?I基因及pEGFP-N1質粒的波爾山羊成纖維細胞克隆放大到10cm細胞培養皿上后，添加10μmol/L的亞油酸和花生四烯酸進行培養，細胞完全長滿后，用胰酶消化收集細胞；細胞用去離子水洗滌，加入2.5％H2SO4/甲醇溶液1mL，80℃加熱90min，冷卻到室溫后加入1.5mL?0.9％NaCl溶液和1mL正己烷，震動、低速離心將脂肪酸提取到有機相；吸取上層清液經液氮吹干后用于氣相色譜(GC_MS)分析；

S9、進行BrdU標記和檢測：在細胞培養過程中加入10mM?BrdU標記12小時后，用70％的乙醇固定，然后用PBS將殘余的乙醇清洗干凈，加入鼠源抗BrdU的抗體作為一抗，二抗用Cy3標記的抗鼠的IGg，奧林巴斯BX51熒光顯微鏡下拍照；

S10、TUNEL法檢測細胞凋亡：在4℃條件下，用4％的多聚甲醛固定細胞25分鐘后，加入熒光素標記的dUTP和末端轉移酶37℃孵育一小時，然后分別用檸檬酸鈉和PBS淋洗細胞，Hoechst?333258用來特異于細胞核著色，在熒光顯微鏡下能發綠色熒光細胞即為凋亡細胞，隨機選取三板，每板上隨機選擇一個區域的至少1000個細胞進行計數，用凋亡細胞數除以細胞總數即為細胞凋亡率；

S11、細胞衰老檢測：將細胞培養于24孔板，用PBS淋洗后，加入β-半乳糖苷酶試劑，室溫孵育15分鐘，PBS淋洗后加入1mL染色試劑，37℃孵育過夜，顯微鏡下拍照；

S12、進行數據統計。

2.根據權利要求1所述的一種山羊的抗衰老基因的合成、轉染及檢測方法，其特征在于，所述步驟S4中電染所用的電擊條件為：電壓：600v，波長：400us。