[發明專利]一種歐洲鰻鱺肝臟細胞系及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201510013504.1
• 申請日: 2015-01-12
• 公開（公告）號: CN104531608A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 鄭在予;楊金先;龔暉;葛均青;林天龍
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00;C12R1/91;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

1.一株歐洲鰻鱺肝臟細胞系EL，該細胞系于2014年12月16日保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏登記入冊編號為CCTCC?NO:C2014239。

2.一種如權利要求1所述的歐洲鰻鱺肝臟細胞系的構建方法，其特征在于：所述構建方法的步驟如下：

1）歐洲鰻鱺的試前準備：健康歐洲鰻鱺幼體黑仔鰻在潔凈海水中于室內暫養1～2周，期間不喂食餌料；

2）歐洲鰻鱺肝臟組織的獲取：將步驟1）準備好的仔鰻置于碎冰中行冰凍麻醉，至魚體對物理刺激應激行為消失為止；以2%碘酊棉球充分擦拭魚體表面去除黏液后，再以75%酒精棉球擦拭魚體表面2～3次，由側面剪開體壁，取出肝臟組織，置于0℃預冷并含青霉素及鏈霉素雙抗的滅菌無鈣鎂D-Hanks平衡鹽溶液中，清洗5～6次；

3）原代培養：將步驟2）得到的歐洲鰻鱺肝臟組織剪碎成0.5?mm³～1mm³大小的組織塊，以步驟2）所述滅菌無鈣鎂D-Hanks平衡鹽溶液漂洗；用不含血清的L-15培養基潤濕培養瓶底面，將漂洗后的組織塊移入25mL培養瓶中，以0.3cm～0.5cm的間距均勻排列；倒置瓶身于20℃密閉培養6～8小時使組織塊貼壁后，在培養瓶中加入原代及早期傳代培養用完全培養液，緩慢翻正瓶身，使培養液浸潤組織塊，于20℃恒溫下啟動原代培養；

4）早期傳代培養：收集生長良好的原代培養物進行早期傳代培養，傳代前棄去培養液和脫落的組織塊，用0.25%胰酶潤洗細胞層，棄去，再加入0.25%胰酶消化細胞，待細胞呈收縮分離態勢時棄去胰酶，加原代及早期傳代培養用完全培養液中止消化，以彎頭滴管吹打培養物至細胞和組織塊大部分分散脫落，收集細胞和組織懸浮液，1000rpm離心3分鐘，去除上清后用完全培養液重懸沉淀，依照細胞和組織塊數量以1:1-2:1的比例在27℃下進行富集化培養，重復以上步驟直至確認培養物連續數代無污染跡象，傳代后細胞能順利形成鋪滿瓶底的單層；

5）常規傳代培養：細胞能穩定形成單層后對其進行常規傳代培養，以顯微鏡法對培養細胞進行連續觀察，當細胞出現均勻的輕微堆疊現象時即行傳代，用0.25%胰酶潤洗細胞層，棄去，再加入0.25%胰酶消化細胞30秒至1分鐘，待上層細胞收縮變圓時棄去胰酶，加入常規傳代培養用完全培養液，用彎頭滴管輕柔吹打至上層細胞脫落制成細胞懸液，將全部細胞懸液移入新瓶，于27℃恒溫下進行常規傳代培養；

6）細胞的凍存及復蘇：當細胞進入常規傳代培養階段后，對其分批進行液氮冷凍保存，凍存液組成為70%L-15、20%胎牛血清以及10%DMSO；復蘇細胞時，以37℃水浴迅速解凍樣品，吸出細胞懸液后與常規傳代培養用完全培養液混勻接種于培養瓶內，12小時后更換培液，去除未成活細胞和DMSO成分后繼續培養。

3.如權利要求2所述的歐洲鰻鱺肝臟細胞系的構建方法，其特征在于：步驟3）和4）所述原代及早期傳代用完全培養液是以L-15培養基為基礎，含終濃度為15%的胎牛血清，終濃度為200U/mL的青霉素，以及終濃度為200μg/mL的鏈霉素的完全培養液。

4.如權利要求2所述的歐洲鰻鱺肝臟細胞系的構建方法，其特征在于：步驟5）所述常規傳代培養用完全培養液是以L-15培養基為基礎，含終濃度為10%的胎牛血清，不含抗生素及其他營養添加物的完全培養液。

5.如權利要求1所述的歐洲鰻鱺肝臟細胞系EL作為水產動物病毒宿主細胞的應用，其特征在于：取對數生長期的EL細胞，在維持性培養基環境下接種鰻鱺皰疹病毒HVA-Ⅱ。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于：所述維持性培養基以L-15培養基為基礎，包含終濃度為2%的胎牛血清。