[發明專利]一種歐洲鰻鱺肝臟細胞系及其構建方法和應用

在審

• 申請號: 201510013504.1
• 申請日: 2015-01-12
• 公開（公告）號: CN104531608A
• 公開（公告）日: 2015-04-22
• 發明（設計）人: 鄭在予;楊金先;龔暉;葛均青;林天龍
• 申請（專利權）人: 福建省農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N7/00;C12R1/91;C12R1/93
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及一種歐洲鰻鱺（Anguilla?Anguilla）肝臟細胞系及其構建方法和應用，屬于海水魚類細胞培養技術領域。

背景技術

魚類細胞培養始于20世紀60年代，自Wolf等1962年建立第一個真骨魚類永久性細胞系——虹鱒生殖腺細胞系RTG-2以來，國內外已建立了250余株魚類細胞系，有40余種病毒采用細胞培養分離成功，魚類胚胎干細胞培養的成功更是有力地促進了基因工程的發展。魚類研究實驗對于養殖場所、設備和水體環境的維持有較高的要求，以魚類培養細胞作為實驗模型,?有著活體魚無法比擬的優點:?(1)?成本低,?細胞系的維護不需要大型的養殖設備和大量的換水與充氣；(2)?重復性好,實驗條件可以精確控制；(3)取樣、觀測簡便易行，利于進行大量樣本的分析。魚類體細胞系模型研究幾十年來發展迅速，已經廣泛應用于病原學、藥理學、生理學、環境毒理學、細胞生物學、腫瘤學以及資源保護等各方面，在病毒學研究中尤其具有重要的地位，被視為病毒性病原分離、鑒定和特性研究的基礎。

鰻鱺養殖業是我國水產業重要的支柱行業，其年產量約占世界總產量的2/3，單項產品出口值在水產品中位居榜首。歐洲鰻鱺（Anguilla?Anguilla）屬鰻鱺目（Anguilliformes）、鰻鱺科（Anguillidae）、鰻鱺屬（Anguilla），原產于大西洋，于1993年首次引入我國，并于同年實現配套飼料國產化；自引養成功以來，歐鰻養殖業迅速發展，90年代末歐洲鰻鱺年產量超過日本鰻鱺，成為我國最重要的養殖鰻鱺品種，其肉質細嫩，味美，富含蛋白質、多種維生素及不飽和脂肪酸，具有極高的營養價值，有“軟黃金”之稱。由于養殖業的迅速發展，養殖布局不合理、密度過大、水流不暢等問題普遍發生，加之時有投喂變質餌料和濫用藥物的狀況，導致魚體免疫力下降和水體污染，各類病害頻繁爆發，其中不乏病毒性病例，而當前已有的歐洲鰻鱺細胞系模型極少，遠不能滿足研究需要。

由于歐洲鰻鱺降河洄游的繁殖習性和復雜多變的生活史，其人工繁殖至今仍是未解的世界級技術難題；而歐鰻胚胎和低齡幼體的難以獲取，和被列為瀕危物種后對玻璃鰻進出口的限制，客觀上增大了歐洲鰻鱺體細胞系建立的難度，更加突顯出這一亟需填補的技術空白的重要性。

發明內容

本發明的目的是提供一種歐洲鰻鱺肝臟細胞系及其構建方法和應用，以彌補現有技術和細胞模型庫的不足，并滿足對歐洲鰻鱺進行病原學分析和生理特性、功能基因組等研究的應用需要。

本發明所涉及的歐洲鰻鱺肝臟細胞系的構建方法，其步驟如下：

1）歐洲鰻鱺的試前準備：健康歐洲鰻鱺幼體黑仔鰻在潔凈海水中于室內暫養1～2周，期間不喂食餌料；

2）歐洲鰻鱺肝臟組織的獲取：將步驟1）準備好的仔鰻置于碎冰中行冰凍麻醉，至魚體對物理刺激應激行為消失為止；以2%碘酊棉球充分擦拭魚體表面去除黏液后，再以75%酒精棉球擦拭魚體表面2～3次，由側面剪開體壁，取出肝臟組織，置于0℃預冷并含青霉素及鏈霉素雙抗的滅菌無鈣鎂D-Hanks平衡鹽溶液中，清洗5～6次；

3）原代培養：將步驟2）得到的歐洲鰻鱺肝臟組織剪碎成0.5mm³～1mm³大小的組織塊，以步驟2）所述滅菌無鈣鎂D-Hanks平衡鹽溶液漂洗；用不含血清的L-15培養基潤濕培養瓶底面，將漂洗后的組織塊移入25mL培養瓶中，以0.3cm～0.5cm的間距均勻排列；倒置瓶身于20℃密閉培養6～8小時使組織塊貼壁后，在培養瓶中加入原代及早期傳代培養用完全培養液，緩慢翻正瓶身，使培養液浸潤組織塊，于20℃恒溫下啟動原代培養；

4）早期傳代培養：收集生長良好的原代培養物進行早期傳代培養，傳代前棄去培養液和脫落的組織塊，用0.25%胰酶潤洗細胞層，棄去，再加入0.25%胰酶消化細胞，待細胞呈收縮分離態勢時棄去胰酶，加原代及早期傳代培養用完全培養液中止消化，以彎頭滴管吹打培養物至細胞和組織塊大部分分散脫落，收集細胞和組織懸浮液，1000rpm離心3分鐘，去除上清后用完全培養液重懸沉淀，依照細胞和組織塊數量以1:1～2:1的比例在27℃下進行富集化培養，重復以上步驟直至確認培養物連續數代無污染跡象，傳代后細胞能順利形成鋪滿瓶底的單層；