[發(fā)明專利]一種用于檢測(cè)人冠狀病毒感染的通用引物序列及檢測(cè)方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510012641.3
• 申請(qǐng)日: 2015-01-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104498636A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-04-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 耿合員;汪圣強(qiáng);謝曉謙;肖雨;張汀;李宗;譚文杰;蘇川
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇國(guó)際旅行衛(wèi)生保健中心無(wú)錫分中心
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 無(wú)錫市匯誠(chéng)永信專利代理事務(wù)所(普通合伙)32260
• 代理人: 張歡勇

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)和病毒學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種新的利用一對(duì)簡(jiǎn)并引物，通過(guò)One-step?RT-PCR反應(yīng)即可達(dá)到對(duì)人冠狀病毒感染定性檢測(cè)的目的。

背景技術(shù)

冠狀病毒(Coronavirus)在病毒學(xué)分類上屬于巢式病毒目(orderNidovirals)、冠狀病毒科(family?Coronavirade)、冠狀病毒屬(genus?Coronavirus)的成員，基因組為單鏈、正鏈的RNA，全長(zhǎng)在26～32kb之間，是目前已知RNA病毒中基因組最大的病毒。冠狀病毒在自然界的感染普非常廣泛，常見(jiàn)的哺乳類動(dòng)物如犬、貓、鼠、豬、牛以及家禽類等都易感。近幾年來(lái)，又從白鯨、駱駝，尤其是蝙蝠體內(nèi)分離到多種類型的冠狀病毒。冠狀病毒依據(jù)核酸序列的系統(tǒng)發(fā)生分析，國(guó)際病毒學(xué)分類委員會(huì)(ICTV，2012)在第九次報(bào)告中將冠狀病毒屬又分成了α、β、γ及δ共四個(gè)亞組。人及其他哺乳類冠狀病毒主要位于α和β亞組，禽類及其它鳥類冠狀病毒主要位于γ和δ亞組。冠狀病毒感染后，能夠侵害機(jī)體的呼吸道、消化道、肝臟、腎臟以及神經(jīng)系統(tǒng)等多種器官，造成不同程度的病理性損，從而引起不同程度的病理性疾病，嚴(yán)重者甚至能造成死亡。

人冠狀病毒目前已知共有六種，分別是二十世紀(jì)60年代最早發(fā)現(xiàn)的人冠狀病毒229E(Human?coronavirus?229E,HCoV-229E)和HCoV-OC43；2002～2003年在我國(guó)廣東地區(qū)出現(xiàn)并迅速爆發(fā)的嚴(yán)重急性呼吸道綜合征(Severe?acute?respiratory?syndrome,SARS)冠狀病毒SARS-CoV；2004年在荷蘭分離的新型人冠狀病毒HCoV-NL63；2005年在香港鑒定的新型人冠狀病毒HCoV-HKU1以及2012年在中東地區(qū)出現(xiàn)的新型中東呼吸綜合征(Middle?East?respiratory?syndrome,MERS)冠狀病毒MERS-CoV。其中，HCoV-229E和HCoV-NL63位于α亞組，HCoV-OC43和HCoV-HKU1位于β亞組中的2a亞組，SARS-CoV屬于β亞組中的2b亞組，MERS-CoV屬于β亞組中的2c亞組。分子流行病學(xué)研究表明，人冠狀病毒主要感染嬰幼兒及免疫功能低下或缺陷者，既能感染上呼吸道引起發(fā)熱、咳嗽、喉炎等普通感冒癥狀，又能感染下呼吸道引起支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎及肺炎等急性呼吸道癥狀。其中，SARS-CoV和MERS-CoV感染后能夠引發(fā)呼吸系統(tǒng)和腎功能衰竭，嚴(yán)重者甚至造成死亡。除了SARS-CoV和MERS-CoV外，冠狀病毒在常見(jiàn)人呼吸道病毒感染中的平均檢出率為15％(Perlman?S,et?al.2009)。

冠狀病毒基因組不連續(xù)的復(fù)制轉(zhuǎn)錄機(jī)制、RNA依賴的RNA聚合酶(RNA?dependent?RNApolymerase,RdRp)復(fù)制的低忠實(shí)性、廣泛的宿主嗜性使其在進(jìn)化過(guò)程中極易發(fā)生堿基的插入、缺失以及基因重組或重配，在此過(guò)程中新型別或新的冠狀病毒不斷出現(xiàn)。因此，深入開(kāi)展冠狀病毒及新出現(xiàn)的冠狀病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查，及時(shí)研發(fā)新的快速、靈敏的分子檢測(cè)技術(shù)對(duì)于闡釋冠狀病毒跨種屬傳播的分子機(jī)制以及滿足快速診斷的要求等具有重要意義。目前，人冠狀病毒分子檢測(cè)方法主要有常規(guī)RT-PCR、real-time?RT-PCR及血清學(xué)診斷法。這些方法通常利用特異性引物針及探針對(duì)某一特定種類的人冠狀病毒進(jìn)行單一檢測(cè)，屬于盲篩檢測(cè)，不僅費(fèi)時(shí)費(fèi)力，而且檢測(cè)試劑昂貴且容易造成污染。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是以GenBank上登陸的目前已知的六種人冠狀病毒全基因組序列為基礎(chǔ)，通過(guò)對(duì)人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對(duì)分析，在基因組多聚酶基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)了一對(duì)簡(jiǎn)并引物用于對(duì)人冠狀病毒的通用定性檢測(cè)。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：

一種用于檢測(cè)人冠狀病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，即：hCoV-For：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG；其下游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，即：hCoV-Rev：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG。

一種用所述通用引物序列檢測(cè)人冠狀病毒感染的檢測(cè)方法，包括：

(1)人冠狀病毒檢測(cè)通用引物設(shè)計(jì)