[發(fā)明專利]一種用于檢測人冠狀病毒感染的通用引物序列及檢測方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510012641.3 | 申請日： | 2015-01-09 |
| 公開（公告）號： | CN104498636A | 公開（公告）日： | 2015-04-08 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 耿合員;汪圣強(qiáng);謝曉謙;肖雨;張汀;李宗;譚文杰;蘇川 | 申請（專利權(quán)）人： | 江蘇國際旅行衛(wèi)生保健中心無錫分中心 |
| 主分類號： | C12Q1/70 | 分類號： | C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11 |
| 代理公司： | 無錫市匯誠永信專利代理事務(wù)所(普通合伙)32260 | 代理人： | 張歡勇 |
| 地址： | 214101江蘇省無錫市錫*** | 國省代碼： | 江蘇;32 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 用于 檢測 冠狀 病毒感染 通用 引物 序列 方法 | ||
1.一種用于檢測人冠狀病毒感染的通用引物序列，其上游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其下游引物核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。
2.一種用權(quán)利要求1所述通用引物序列檢測人冠狀病毒感染的檢測方法，其特征在于，包括：
(1)人冠狀病毒檢測通用引物設(shè)計
通過對GenBank上登錄的六種人冠狀病毒全基因組核酸序列的比對分析，在基因組多聚酶基因編碼區(qū)設(shè)計了一對簡并引物hCoV-For和hCoV-Rev用于對人冠狀病毒感染的初步確診，引物對序列分別為上游引物hCoV-For：ATGGGWTGGGAYTAYCCHAARTGTG，下游引物hCoV-Rev：TGYTGKGARCARAAYTCRTGWGG，擴(kuò)增目的片段大小為605bp；
(2)人冠狀病毒通用引物One-step?RT-PCR檢測驗(yàn)證
利用QIAamp?Viral?RNA?Mini?kit分別從四種人冠狀病毒：HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E和HCoV-HKU1的陽性樣本中提取病毒RNA，然后以hCoV-For和hCoV-Rev為引物對，通過One-step?RT-PCR?Quick?Master?Mix對四種人冠狀病毒分別進(jìn)行檢測驗(yàn)證。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中，對四種人冠狀病毒分別進(jìn)行檢測驗(yàn)證的反應(yīng)體系為25μL：2x?RT-PCR?Quick?Master?Mix?12.5μL，50mM?Mn(OAC)21.25μL，10μM?hCoV-For?和hCoV-Rev各1μL，病毒RNA?5μL，去離子水7.25μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?0℃30s，60℃30min，94℃，1min；94℃30s,56℃30s,72℃1min,35個循環(huán)；72℃7min；反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.2％瓊脂糖凝膠電泳后在紫外燈下觀察結(jié)果，結(jié)果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進(jìn)行One-step?RT-PCR反應(yīng)后都能擴(kuò)增出大小600bp的單一目的條帶，PCR產(chǎn)物經(jīng)測序驗(yàn)證后序列正確且不存在交叉反應(yīng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中人冠狀病毒通用引物One-step?RT-PCR檢測驗(yàn)證包括人冠狀病毒通用引物One-step?RT-PCR檢測靈敏性驗(yàn)證和人冠狀病毒通用引物One-step?RT-PCR檢測特異性驗(yàn)證。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述人冠狀病毒通用引物One-step?RT-PCR檢測靈敏性驗(yàn)證，利用QIAamp?Viral?RNAMini?kit提取人冠狀病毒RNA，并用分光光度計進(jìn)行定量，并通過公式計算出每微升的拷貝數(shù)，將病毒RNA進(jìn)行稀釋，然后分別取各個稀釋倍數(shù)的RNA為模板進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果表明，每反應(yīng)病毒RNA拷貝數(shù)從1.6x109到1.6x103是均能擴(kuò)增出目的條帶，而每反應(yīng)病毒RNA拷貝數(shù)從1.6x102到1.6x100均不能擴(kuò)增出目的條帶，上述結(jié)果表明，該人冠狀病毒通用引物One-step?RT-PCR最低檢測下限為1600拷貝/每反應(yīng)，與常規(guī)單一冠狀病毒檢測所用RT-PCR及real-time?RT-PCR靈敏性相當(dāng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測方法，其特征在于，所述人冠狀病毒?通用引物One-step?RT-PCR檢測特異性驗(yàn)證，病毒RNA分別以HCoV-NL63、HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-HKU1以及Influenza?virusA、Influenza?virus?B、諾如病毒、呼吸道合胞體病毒、副流感病毒、人鼻病毒為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，分別以上述四種人冠狀病毒RNA為模板，以hCoV-For和hCoV-Rev為通用引物進(jìn)行One-step?RT-PCR反應(yīng)后都能擴(kuò)增出大小為600bp的單一目的條帶，而加入其它病毒RNA模板均不能擴(kuò)增出條帶，表明該人冠狀病毒通用檢測引物對特異性較好。
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