[發(fā)明專利]一種基于SSR標(biāo)記的京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510012415.5
• 申請日: 2015-01-04
• 公開（公告）號: CN104561319A
• 公開（公告）日: 2015-04-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張麗;王慶彪
• 申請（專利權(quán)）人: 北京市農(nóng)林科學(xué)院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定的引物序列及檢測方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

蘿卜在中國栽培歷史悠久，分布廣泛，品種類型十分豐富，在我國蔬菜生產(chǎn)供應(yīng)中占有重要地位。但是，目前蘿卜種子經(jīng)營單位越來越多，種子質(zhì)量參差不齊，嚴(yán)重干擾了蘿卜種業(yè)的健康發(fā)展。在蘿卜F1代雜交種制種過程中由于生物學(xué)混雜和機械混雜等原因造成雜交種純度降低現(xiàn)象時有發(fā)生，給種子生產(chǎn)者和經(jīng)營者造成巨大經(jīng)濟損失。傳統(tǒng)的種子純度鑒定方法都是在田間進行，觀察主要發(fā)育階段品種的特征特性及一致性，存在周期長、工作量大等缺陷。此外由于田間純度檢測周期長，造成當(dāng)年生產(chǎn)的雜交種往往要等到次年才能銷售，不但會造成庫存壓力，還會錯失商機。

近年來隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基于DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記正逐漸成為分析生物遺傳多樣性的有力工具，因其具有不受環(huán)境影響、測試周期短、供選擇的標(biāo)記數(shù)量多、可以進行高通量測試分析的優(yōu)勢，已經(jīng)大規(guī)模用于種子純度鑒定及品種真?zhèn)涡缘臋z測。尤其是微衛(wèi)星(SSR)標(biāo)記技術(shù)具有共顯性、多態(tài)性好、重復(fù)性好、實驗操作簡單等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。

“京紅4號”是北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心育成的紅皮系列蘿卜品種之一，具有肉質(zhì)根皮色粉紅、根形圓正、抗病性強、熟食品質(zhì)佳等優(yōu)點，適于華北、東北地區(qū)秋季種植。該品種種植面積不斷擴大，種子需求量和制種面積也相應(yīng)增加，快速鑒定雜交種純度將有利于該品種的進一步推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測京紅4號蘿卜雜交種純度的引物序列。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種利用上述引物進行京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一對用于檢測京紅4號蘿卜雜交種純度的引物序列，包括核苷酸序列如序列表中SEQ?ID?No.1～2所示序列。

利用上述引物進行京紅4號蘿卜雜交種純度鑒定，方法包括如下步驟：

(1)提取待測樣品京紅4號雜交種基因組DNA；

(2)采用序列表SEQ?ID?No.1～2所示引物進行PCR擴增；

(3)將步驟(2)中的擴增產(chǎn)物經(jīng)10％聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法染色，照相并統(tǒng)計結(jié)果；

(4)利用步驟(3)的統(tǒng)計結(jié)果計算京紅4號蘿卜雜交種的純度。

所述步驟(1)是采用堿裂解法快速提取待測京紅4號蘿卜雜交種基因組DNA：取種子下胚軸(發(fā)芽72小時)置于2.0mL離心管中；加入0.4mol?L^-1NaOH溶液100μl，鋼珠2個；在48孔研磨器上研磨1min；輕甩離心后，放于沸水中溫浴1min；10000rmp離心1min；取上清液10μl放入96孔PCR板中，加200μl?Tris緩沖液(PH＝8.0)，混勻備用。

所述步驟(2)為PCR擴增：采用如序列表SEQ?ID?No.1～2所示引物，反應(yīng)體系為：1μl?10×Buffer(含Mg²⁺)，0.8μl?2.5mM?dNTP，1U?Taq?DNA聚合酶，10μM?SSR上下游引物各加0.5μl，模板DNA?2μl，ddH₂O補足10μl；PCR反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min；35個擴增循環(huán)，94℃30sec，60℃30sec，72℃1min；72℃延伸7min，4℃保存。

所述步驟(3)擴增產(chǎn)物的檢測：在步驟(2)的擴增產(chǎn)物中加入2μl上樣緩沖液，經(jīng)10％非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1×TBE，每個點樣孔加2μl樣品，120V恒壓下電泳60分鐘。電泳結(jié)束后利用銀染法染色。先將凝膠放入固定液(450mL?H₂O+50mL無水乙醇+2.5mL冰醋酸)，在搖床上輕搖12min，回收固定液待用；加入銀染液(500ml?H₂O+1g硝酸銀)，輕搖12min；倒掉銀染液，用500ml蒸餾水洗30s，清洗兩次；清洗后，倒掉蒸餾水加入顯色液(500ml?H₂O+7.5gNaOH+1500μl甲醛)，輕搖至DNA條帶顯出為止；當(dāng)條帶清晰時，倒掉顯影液，加入固定液，固定2分鐘；倒掉固定液，用蒸餾水漂洗5分鐘；照相并統(tǒng)計帶型。比較京紅4號雜交種及其雙親的特征譜帶，表現(xiàn)共顯性互補帶型的京紅4號雜交種，只有親本帶型的為非雜交種，出現(xiàn)其他第三種帶型的為外來雜種；