[發明專利]一種以富馬酸為原料多酶偶聯制備DL-丙氨酸的方法

有效

• 申請號: 201510003152.1
• 申請日: 2015-01-05
• 公開（公告）號: CN104531820B
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發明（設計）人: 焦慶才;劉均忠;吳四平;陸陽;高亮;劉茜
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P13/06;C12R1/19;C12R1/38;C12R1/15
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 胡錫瑜

1.一種以富馬酸為原料多酶偶聯制備DL-丙氨酸的方法，其特征是該方法為：

(1)將具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌Escherichia coli、具有天冬氨酸-β-脫羧酶活性的徳阿昆哈假單胞菌Pseudomonas dacunhae和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum分別在培養基中培養，產生高酶活天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脫羧酶和丙氨酸消旋酶；培養基碳源采用葡萄糖或麥芽糖或蔗糖或果糖，培養基中總碳源質量濃度為1～30g/L，氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米漿或蛋白胨或豆餅水解液，培養基中總氮源質量濃度為1～30g/L；

(2)取具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌濕菌體0.7g，具有天冬氨酸-β-脫羧酶活性的徳阿昆哈假單胞菌濕菌體10g和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒桿菌濕菌體10g，加入到1000mL轉化液中，轉化液中含200g/L富馬酸、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L TritonX-100，pH 6.0，40℃酶促反應24h，反應液旋光為0， 反應結束后轉化液中DL-丙氨酸濃度為147.3g/L，對富馬酸摩爾轉化率為96％；

(3)將轉化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至280mL，冷卻結晶到室溫，抽濾、烘干得固體DL-丙氨酸100.5g；

(4)將結晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫DL-丙氨酸飽和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脫液700mL，活性炭脫色后真空濃縮至180mL，趁熱加入二倍體積95％乙醇，室溫冷卻結晶，抽濾、烘干得固體DL-丙氨酸31.5g，結晶母液回收乙醇后循環套用， 兩次結晶共得DL-丙氨酸132g，收率89.6％。

2.一種以富馬酸為原料多酶偶聯制備DL-丙氨酸的方法，其特征是該方法為：

(1)將具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌、具有天冬氨酸-β-脫羧酶活性的徳阿昆哈假單胞菌和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒桿菌分別在培養基中培養，產生高酶活天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脫羧酶和丙氨酸消旋酶；培養基碳源采用葡萄糖或麥芽糖或蔗糖或果糖，培養基中總碳源質量濃度為1～30g/L，氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米漿或蛋白胨或豆餅水解液，培養基中總氮源質量濃度為1～30g/L；

(2)取具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌濕菌體0.7g，具有天冬氨酸-β-脫羧酶活性的徳阿昆哈假單胞菌濕菌體10g和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒桿菌濕菌體10g，加入到1000mL轉化液中，轉化液中含150g/L富馬酸、0.1g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L CTAB，pH 7.0，55℃酶促反應20h，反應液旋光為0，反應結束后轉化液中DL-丙氨酸濃度為109.4g/L，對富馬酸摩爾轉化率為95％；

(3)將轉化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經過超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至200mL，冷卻結晶到室溫，抽濾、烘干得固體DL-丙氨酸73g；

(4)將結晶母液稀釋后通過732型陽離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫DL-丙氨酸飽和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脫液500mL，活性炭脫色后真空濃縮至150mL，趁熱加入二倍體積95％乙醇，室溫冷卻結晶，抽濾、烘干得固體DL-丙氨酸24.4g，結晶母液回收乙醇后循環套用，兩次結晶共得DL-丙氨酸97.4g，收率89％。