[發(fā)明專利]一種以富馬酸為原料多酶偶聯(lián)制備DL-丙氨酸的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201510003152.1 | 申請(qǐng)日： | 2015-01-05 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN104531820B | 公開（公告）日： | 2018-04-24 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 焦慶才;劉均忠;吳四平;陸陽(yáng);高亮;劉茜 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 南京大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12P39/00 | 分類號(hào)： | C12P39/00;C12P13/06;C12R1/19;C12R1/38;C12R1/15 |
| 代理公司： | 南京知識(shí)律師事務(wù)所32207 | 代理人： | 胡錫瑜 |
| 地址： | 210093 江*** | 國(guó)省代碼： | 江蘇;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 富馬酸 原料 多酶偶聯(lián) 制備 dl 丙氨酸 方法 | ||
1.一種以富馬酸為原料多酶偶聯(lián)制備DL-丙氨酸的方法，其特征是該方法為：
(1)將具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌Escherichia coli、具有天冬氨酸-β-脫羧酶活性的徳阿昆哈假單胞菌Pseudomonas dacunhae和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum分別在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生高酶活天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脫羧酶和丙氨酸消旋酶；培養(yǎng)基碳源采用葡萄糖或麥芽糖或蔗糖或果糖，培養(yǎng)基中總碳源質(zhì)量濃度為1～30g/L，氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米漿或蛋白胨或豆餅水解液，培養(yǎng)基中總氮源質(zhì)量濃度為1～30g/L；
(2)取具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌濕菌體0.7g，具有天冬氨酸-β-脫羧酶活性的徳阿昆哈假單胞菌濕菌體10g和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒桿菌濕菌體10g，加入到1000mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含200g/L富馬酸、0.2g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L TritonX-100，pH 6.0，40℃酶促反應(yīng)24h，反應(yīng)液旋光為0， 反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中DL-丙氨酸濃度為147.3g/L，對(duì)富馬酸摩爾轉(zhuǎn)化率為96％；
(3)將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過(guò)超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至280mL，冷卻結(jié)晶到室溫，抽濾、烘干得固體DL-丙氨酸100.5g；
(4)將結(jié)晶母液稀釋后通過(guò)732型陽(yáng)離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫DL-丙氨酸飽和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脫液700mL，活性炭脫色后真空濃縮至180mL，趁熱加入二倍體積95％乙醇，室溫冷卻結(jié)晶，抽濾、烘干得固體DL-丙氨酸31.5g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用， 兩次結(jié)晶共得DL-丙氨酸132g，收率89.6％。
2.一種以富馬酸為原料多酶偶聯(lián)制備DL-丙氨酸的方法，其特征是該方法為：
(1)將具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌、具有天冬氨酸-β-脫羧酶活性的徳阿昆哈假單胞菌和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒桿菌分別在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，產(chǎn)生高酶活天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脫羧酶和丙氨酸消旋酶；培養(yǎng)基碳源采用葡萄糖或麥芽糖或蔗糖或果糖，培養(yǎng)基中總碳源質(zhì)量濃度為1～30g/L，氮源采用牛肉膏或酵母膏或玉米漿或蛋白胨或豆餅水解液，培養(yǎng)基中總氮源質(zhì)量濃度為1～30g/L；
(2)取具有天冬氨酸酶活性的大腸桿菌濕菌體0.7g，具有天冬氨酸-β-脫羧酶活性的徳阿昆哈假單胞菌濕菌體10g和具有丙氨酸消旋酶活性的谷氨酸棒桿菌濕菌體10g，加入到1000mL轉(zhuǎn)化液中，轉(zhuǎn)化液中含150g/L富馬酸、0.1g/L磷酸吡哆醛和0.2g/L CTAB，pH 7.0，55℃酶促反應(yīng)20h，反應(yīng)液旋光為0，反應(yīng)結(jié)束后轉(zhuǎn)化液中DL-丙氨酸濃度為109.4g/L，對(duì)富馬酸摩爾轉(zhuǎn)化率為95％；
(3)將轉(zhuǎn)化液4000r/min離心15min去除菌體，上清液升溫到70～80℃，加入活性炭脫色，脫色液經(jīng)過(guò)超濾和納濾凈化處理，凈化液真空濃縮至200mL，冷卻結(jié)晶到室溫，抽濾、烘干得固體DL-丙氨酸73g；
(4)將結(jié)晶母液稀釋后通過(guò)732型陽(yáng)離子交換樹脂柱分離，用3％氨水洗脫DL-丙氨酸飽和吸附柱，收集含DL-丙氨酸的洗脫液500mL，活性炭脫色后真空濃縮至150mL，趁熱加入二倍體積95％乙醇，室溫冷卻結(jié)晶，抽濾、烘干得固體DL-丙氨酸24.4g，結(jié)晶母液回收乙醇后循環(huán)套用，兩次結(jié)晶共得DL-丙氨酸97.4g，收率89％。
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