[發明專利]一種以富馬酸為原料多酶偶聯制備DL-丙氨酸的方法

有效

• 申請號: 201510003152.1
• 申請日: 2015-01-05
• 公開（公告）號: CN104531820B
• 公開（公告）日: 2018-04-24
• 發明（設計）人: 焦慶才;劉均忠;吳四平;陸陽;高亮;劉茜
• 申請（專利權）人: 南京大學
• 主分類號: C12P39/00
• 分類號: C12P39/00;C12P13/06;C12R1/19;C12R1/38;C12R1/15
• 代理公司: 南京知識律師事務所32207
• 代理人: 胡錫瑜

一、技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種以富馬酸為原料多酶偶聯制備DL-丙氨酸的方法。

二、背景技術

DL-丙氨酸是人體的非必需氨基酸之一，可用于醫藥、食品、化妝品和飼料添加劑等領域，具有非常廣泛的應用。

目前根據文獻報道DL-丙氨酸的制備方法主要有化學合成法、直接發酵法和生物酶法。

1、化學合成法

化學合成法有Strecker法、Buchere法、α-鹵代羧酸氨化法、相轉移催化合成法和L-丙氨酸化學消旋法。其中Strecker和Buchere法原料價格便宜，但中間產物水解后分離比較困難，特別是DL-丙氨酸與副產物分離比較復雜，氰化物的運輸和管理難度大，國內外未見報道采用該工藝大規模生產DL-丙氨酸的企業。

Kendall E C等(Organic Synthesis,1929,9:4)以乙醛為原料，加入氰化氫得氰醇，加入氨溶液反應生成氨基腈，再加堿水解得到丙氨酸的鈉鹽，經離子交換樹脂處理得到DL-丙氨酸。

賈京潭(CN 1887857A)以L-丙氨酸為原料，以冰醋酸為溶劑加熱至80～110℃溶解，維持溫度95～100℃得DL-丙氨酸的粗品液，經分離制得DL-丙氨酸。

2、直接發酵法

直接發酵法生產DL-丙氨酸所用原材料為葡萄糖，根據目前已報道的發酵水平來看，糖酸轉化效率較低，發酵液組成復雜提取成本高。該法的生產成本遠高于化學合成法，目前國內未見有發酵法大規模工業生產DL-丙氨酸的報道。

張克旭(化學工業出版社,1992,723-725)利用膠狀棒桿菌No.7183在含有葡萄糖、酵母膏、玉米漿、尿素、磷酸二氫鉀和硫酸鎂成分的培養基中發酵生產DL-丙氨酸，DL-丙氨酸發酵產酸率40g/L。

李良鑄(化學工業出版社,2006,116-118)利用嗜氨小桿菌的精氨酸氧肟酸抗性菌株，在含有硫酸鋅的葡萄糖培養基中發酵生產DL-丙氨酸，DL-丙氨酸發酵產酸率60g/L。

3、生物酶法

生物酶法生產工藝是以L-丙氨酸為原料、丙氨酸消旋酶為催化劑的一步生化反應，其設備簡單、反應條件溫和、酶活力高、反應速度快、具有專一性強的特點。酶法生產DL-丙氨酸已成為近年來人們關注和研究的方向。

黃建坡(CN 101575624A)以微生物濕菌體或粗酶液為酶源，以L-丙氨酸為底物，于20～40℃酶促轉化，轉化至旋光為零后0.5～2h停止反應，得到含DL-丙氨酸的反應液，經分離提取制得DL-丙氨酸，收率75％。

張曉斌(CN 101580858A)以誘變的大腸桿菌濕菌體或粗酶液為酶源，以L-丙氨酸為底物，于37～40℃酶促轉化，轉化時間12h左右，得到含DL-丙氨酸的反應液，經分離提取制得DL-丙氨酸，其中L-丙氨酸轉化率96％以上。

Junlin Liu等(World J Microbiol Biotechnol 2012,28:267–274)以L-丙氨酸為底物，以丙氨酸消旋酶基因工程菌(pET-32a-Alr/BL21)酶法合成了DL-丙氨酸。

三、發明內容

本發明需要解決的問題是提供一種高效、低成本的以富馬酸為原料直接制備DL-丙氨酸的方法。

本發明以富馬酸為原料，以天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脫羧酶和丙氨酸消旋酶復合酶為生物催化劑多酶偶聯制備DL-丙氨酸。

本發明可以通過以下技術方案來達到：

一種以富馬酸為原料多酶偶聯轉化制備DL-丙氨酸的方法，其步驟為：

(1)將分別具有天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脫羧酶和丙氨酸消旋酶活性的菌株在培養基中培養，產生高活性的天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脫羧酶和丙氨酸消旋酶；

(2)將分別具有天冬氨酸酶、天冬氨酸-β-脫羧酶和丙氨酸消旋酶活性的濕菌體或粗酶液與一定濃度的富馬酸銨水溶液混合，再加入適量的磷酸吡哆醛、表面活性劑，在25～55℃，pH 6～8條件下進行酶促反應，利用等電點結晶或等電點結晶與離子交換樹脂相結合的方法分離制備反應生成的DL-丙氨酸。