[發明專利]一種用于核酸隨機片段化的引物及核酸隨機片段化方法

有效

• 申請號: 201480082163.7
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN106715714B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 耿春雨;韓鴻雁;章文蔚;郭冠瑛;蔣慧;江媛
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;羅瑤

本發明提供了用于核酸隨機片段化的引物及核酸隨機片段化方法。所述引物由若干條上游隨機引物和下游隨機引物組成；上游隨機引物序列組成為：5’?X?Y?3’；下游隨機引物序列組成為：5’?P?Y’?X’?close?3’；Y和Y’為隨機序列，X為測序平臺5’端接頭全部或部分序列，X’為測序平臺5’端接頭全部或部分序列，P為磷酸化修飾，close為封閉修飾。本發明的引物利用上下游隨機引物的雙隨機錨定，能對DNA樣品進行隨機打斷。

技術領域

本申請涉及核酸破碎處理領域，特別是涉及一種用于核酸隨機片段化的引物，以及基于該引物的核酸隨機片段化的方法。

背景技術

自從羅氏發明了焦磷酸測序方法開辟了二代測序以來，直至現在，二代測序經歷了一段高速發展期。但隨著高通量測序的發展，高通量和低成本的樣本制備環節逐漸成了測序領域的一個重點考慮的因素。各種原理的樣本處理方法及自動化裝置不斷被研發出來，主要包括：樣本片段化、核酸分子的末端處理及接頭連接等。

其中樣本片段化主要分為物理方法，如超聲剪切，或酶學方法，即非特異的核酸內切酶處理，兩種方法來實現。其中物理方法以基于專利的自適應聚焦超聲（AdaptiveFocused Acoustic，AFA）技術的Covaris為主。在等溫的條件下，利用幾何聚焦聲波能量，通過400kHz的球面固態超聲傳感器，將波長為1mm的聲波能量聚焦在樣品上。該方法確保了核酸樣品的完整性得以保留，并能實現高回收率。Covaris的儀器包括經濟的M系列、單管全功率的S系列以及更高通量的E和L系列。基于物理方法打斷的片段隨機性良好，但是通量上也要依賴大量的Covaris打斷儀，同時需要后續單獨進行末端處理、加接頭和PCR以及各種純化操作。其中酶學方法有一種NEB公司推出的NEB Next dsDNAFragmentase。該試劑首先在雙鏈DNA產生隨機的切刻位點，然后通過另一種酶識別切刻位點來切割互補的DNA鏈，從而實現打斷的目的。這種試劑可以用于基因組DNA、全基因組擴增產物和PCR產物等，隨機性也較好，但是會產生一些人工短片段插入和缺失，同時也不可避免的需要后續單獨進行末端處理、加接頭和PCR以及相應的純化操作。另外以Epicentra公司的Nextera試劑盒領銜的轉座酶打斷試劑盒，利用轉座酶同時完成DNA片段化和接頭的添加，從而減少樣品處理的時間。

從各種操作的簡便性來看，轉座酶打斷的方式無疑在通量及操作簡便性上遠遠勝過其它方法，但是這種打斷方式也有自身的缺點：轉座酶實現轉座依賴特定的19bp Me序列。因此，雖然轉座酶可以通過包埋兩種完全不同的接頭序列而在靶序列的5’端和3’端加上不同的接頭序列，但是接頭均需要含有Me特定序列，從而帶來的一個影響即打斷所產生的片段的兩端會對稱的各有一個Me序列，并且由于轉座酶的特殊作用使得目的序列或打斷片段與Me序列之間存在一個9nt堿基缺失的缺口。靶序列鄰近的兩端完全一致的Me序列會對下游的一些技術應用帶來影響，比如基于連接法的二代測序技術，同一條鏈兩側的Me序列為互補的序列，從而容易引起單鏈分子內部出現退火而不利于錨定引物的結合。

曾經有相關專利申請CN 102703426 A提出了一種解決辦法，即將打斷后的序列進行特定內切酶酶切，從而去除9nt序列和Me序列，這種方法只是利用了轉座酶打斷的優勢將核酸序列進行隨機打斷，但是引入了后續接頭需要單獨進行加入的缺點，步驟繁瑣而不易于更高通量的應用。

發明內容

本申請的目的是提供一種新的用于核酸隨機片段化的引物，在此基礎上，提供了一種新的DNA雙隨機引物破碎方法，即核酸隨機片段化的方法。

為了實現上述目的，本申請采用了以下技術方案：

本申請一方面公開了一種用于核酸隨機片段化的引物，該引物由若干條上游隨機引物和若干條下游隨機引物組成；上游隨機引物的序列組成為：5’-X-Y-3’；下游隨機引物的序列組成為：5’-P-Y’-X’-close-3’；其中，Y和Y’為隨機序列，X為測序平臺的5’端接頭的全部或部分序列，X’為測序平臺的3’端接頭的全部或部分序列，P為磷酸化修飾，close為用于阻止3-5磷酸二酯鍵形成的封閉修飾。