[發明專利]一種用于核酸隨機片段化的引物及核酸隨機片段化方法

有效

• 申請號: 201480082163.7
• 申請日: 2014-10-17
• 公開（公告）號: CN106715714B
• 公開（公告）日: 2021-11-09
• 發明（設計）人: 耿春雨;韓鴻雁;章文蔚;郭冠瑛;蔣慧;江媛
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;羅瑤

1.一種核酸隨機片段化的方法，包括采用引物對DNA樣品進行雙隨機錨定，所述引物由若干條上游隨機引物和若干條下游隨機引物組成；具體包括，將所述上游隨機引物和所述下游隨機引物雜交到變性的DNA樣品上，在最相鄰的上游隨機引物和下游隨機引物之間，通過DNA聚合酶的作用，上游隨機引物向3’端延伸，將上游隨機引物和下游隨機引物之間的序列填滿，然后在DNA連接酶的作用下，將上游隨機引物延伸序列的3’端與下游隨機引物的5’端連接起來，即將上游隨機引物及其延伸序列與下游隨機引物連接成一段，通過上游隨機引物和下游隨機引物的隨機雜交實現對DNA樣品的雙隨機打斷；

將所述上游隨機引物和所述下游隨機引物雜交到變性的DNA樣品上的過程中，所述上游隨機引物和所述下游隨機引物的總用量為R×n皮摩爾，其中2.7≤R≤750，n=1.515×(m÷L)，m為DNA樣品的重量，單位為納克，L為預計打斷后的DNA片段長度，n為將DNA樣品破碎至L長度的片段所需要的上游隨機引物和下游隨機引物理論用量，單位為皮摩爾；

所述上游隨機引物和所述下游隨機引物的摩爾用量比為上游隨機引物：下游隨機引物=1~3:1；

所述上游隨機引物的序列組成為：5’-X-Y-3’；

所述下游隨機引物的序列組成為：5’-P-Y’-X’-close-3’；

其中，Y和Y’為隨機序列，X為測序平臺的5’端接頭的全部或部分序列，X’為測序平臺的3’端接頭的全部或部分序列，P為磷酸化修飾，close為用于阻止3-5磷酸二酯鍵形成的封閉修飾；

使用時，所述上游隨機引物和下游隨機引物雜交結合在同一條模板鏈上，通過上游隨機引物向3’端延伸，將與上游隨機引物最近的下游隨機引物之間的空隙填滿，上游隨機引物的延伸序列的3’端與下游隨機引物的5’端連接起來，將上游隨機引物及其延伸序列與下游隨機引物連成一段；

所述封閉修飾為雙脫氧修飾；

所述上游隨機引物的X序列的5’端還包括2-6個保護堿基；所述下游隨機引物的X’序列3’端還包括2-6個保護堿基，并且所述封閉修飾在末端的一個保護堿基之上；

所述上游隨機引物的X序列具有Seq ID No.1所示序列，所述下游引物的X’序列具有Seq ID No.2所示序列；

Seq ID No.1：5’-GACCGCTTGGCCTCCGACT-3’；

Seq ID No.2：5’-GTCTCCAGTCGAAGCCCGA-3’；

所述上游隨機引物的X序列的5’端的保護堿基為“GAC”，所述下游隨機引物的X’序列3’端的保護堿基為“CG”。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述上游隨機引物和所述下游隨機引物的摩爾用量比為上游隨機引物：下游隨機引物=2:1。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：R=20。

4.一種核酸文庫的構建方法，包括采用權利要求1-3任一項所述的方法對DNA樣品進行隨機片段化，然后采用一對通用引物對雙隨機打斷的DNA片段進行PCR擴增，即獲得隨機片段富集的核酸文庫；所述通用引物由正向引物和反向引物組成，所述正向引物的3’端具有所述測序平臺的5’端接頭的全部或部分序列，所述反向引物的3’端具有所述測序平臺的3’端接頭的反向互補序列的全部或部分。

5.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：所述正向引物和反向引物的5’端分別具有第二測序平臺的接頭序列。

6.根據權利要求4所述的構建方法，其特征在于：所述正向引物含有Seq ID No.1所示序列，所述反向引物含有Seq ID No.3所示序列；

Seq ID No.3：5’-TCGGGCTTCGACTGGAGAC-3’。