[發明專利]一種核酸的轉座酶打斷一站式處理方法及試劑

有效

• 申請號: 201480082159.0
• 申請日: 2014-10-14
• 公開（公告）號: CN107075560B
• 公開（公告）日: 2021-01-26
• 發明（設計）人: 耿春雨;郭榮榮;陳若瑩;張迎新;安德烈·阿萊克謝耶夫;蔣慧;章文蔚
• 申請（專利權）人: 深圳華大智造科技股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 彭家恩;羅瑤

本發明公開了一種核酸的轉座酶打斷一站式處理方法及試劑。本發明的方法，包括如下步驟：使用轉座酶包埋復合體對核酸進行隨機打斷，其中轉座酶包埋復合體包含轉座酶和含轉座酶識別序列的第一接頭；加入第一試劑進行處理，打破轉座酶與核酸的靶序列的吸附作用；加入第二試劑進行處理，減弱第一試劑對后續酶促反應的影響；以第二試劑處理后的產物為模板成分進行PCR反應，得到打斷的核酸片段兩端連接有接頭的PCR產物。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，尤其涉及一種核酸的轉座酶打斷一站式處理方法及試劑。

背景技術

自從羅氏發明了焦磷酸測序方法開辟了二代測序以來，直至現在，二代測序經歷了一段高速發展期。但隨著高通量測序的發展，高通量和低成本的樣本制備環節逐漸成了測序領域的一個重點考慮的因素。各種原理的樣本處理方法及自動化裝置不斷被研發出來，主要包括：樣本片段化、核酸分子的末端處理及接頭連接并最終的出庫。

其中樣本片段化主要分為物理方法(如超聲剪切)或酶學方法(即非特異的核酸內切酶處理)來實現。其中物理方法以基于專利的自適應聚焦超聲(Adaptive FocusedAcoustic，AFA)技術的Covaris為主。在等溫的條件下，利用幾何聚焦聲波能量，通過＞400kHz的球面固態超聲傳感器，將波長為1mm的聲波能量聚焦在樣品上。該方法確保了核酸樣品的完整性得以保留，并能實現高回收率。Covaris的儀器包括經濟的M系列、單管全功率的S系列以及更高通量的E和L系列。基于物理方法打斷的片段隨機性良好，但是通量上也要依賴大量的Covaris打斷儀，同時需要后續單獨進行末端處理、加接頭和PCR以及各種純化操作。其中酶學方法有一種NEB公司推出的NEB Next dsDNA Fragmentase。該試劑首先在雙鏈DNA產生隨機的切刻位點，然后通過另一種酶識別切刻位點來切割互補的DNA鏈，從而實現打斷的目的。這種試劑可以用于基因組DNA、全基因組擴增產物和PCR產物等，隨機性也較好，但是會產生一些人工短片段插入和缺失，同時也不可避免的需要后續單獨進行末端處理、加接頭和PCR以及相應的純化操作。另外以Epicentra公司(已被Illumina收購)的Nextera試劑盒領銜的轉座酶打斷試劑盒，利用轉座酶同時完成DNA片段化和接頭的添加，從而減少樣品處理的時間。

從各種操作的簡便性來看，轉座酶打斷的方式無疑在通量及操作簡便性上遠遠勝過其它方法，但是這種打斷方式也有自身的缺點：轉座酶包埋在靶序列上會抑制后續的酶反應，雖然相關轉座酶試劑盒生產商提供了一些試劑用于低起始量(如5ng起始量基因組DNA)樣本的轉座酶處理，從而實現打斷后無需純化。但是對于50ng起始量這種需要提高轉座酶用量的方法，則需要通過過柱或磁珠純化的方式將轉座酶去除，這無疑加大了實驗操作的成本和流程(圖1A)。

發明內容

本發明提供一種核酸的轉座酶打斷一站式處理方法及試劑，該方法和試劑能夠實現從核酸的轉座酶打斷到下游的PCR擴增反應的一站式處理，不需要過柱或磁珠純化，從而簡化了實驗操作流程并降低實驗成本。

根據本發明的第一方面，本發明提供一種核酸的轉座酶打斷一站式處理方法，包括如下步驟：

使用轉座酶包埋復合體對核酸進行隨機打斷，其中轉座酶包埋復合體包含轉座酶和含轉座酶識別序列的第一接頭；

加入第一試劑進行處理，打破轉座酶與核酸的靶序列的吸附作用；

加入第二試劑進行處理，減弱第一試劑對后續酶促反應的影響；

以第二試劑處理后的產物為模板成分進行PCR反應，得到打斷的核酸片段兩端連接有接頭的PCR產物。

在本發明的方法中，采用第一試劑處理轉座酶打斷核酸后的反應產物，以打破轉座酶與核酸的靶序列的吸附作用，替代了傳統的流程復雜且成本較高的過柱或磁珠純化步驟，然后采用第二試劑處理，以減弱第一試劑對后續酶促反應的影響，保證下游的PCR擴增順利進行。